Effects of Ca2+, microRNAs, and rosuvastatin on insulin-secreting beta cell function

Abstract

Type 2 diabetes (T2D) is a condition of high blood glucose levels due to insulin resistance and defective insulin secretion. Impaired insulin secretion plays a major role in the pathophysiology of T2D, it is mainly attributed to beta cell function i.e. failure to secrete insulin or reduced beta cell mass. The exocytotic process is crucial for beta cell function and its dysregulation leads to impaired insulin secretion. Therefore, understanding the central mechanisms involved in the regulation of exocytosis is essential to recognize possible targets for therapeutic intervention and treatment of T2D. In this thesis I have investigated the role of Ca2+, miRNAs and rosuvastatin in the regulation of ion channels, exocytosis and insulin secretion of beta cells. For this purpose, pancreatic rat INS-1 832/13 beta cells, rodent animal models, and islets from human cadaver donors has been used. Whole-cell patch clamp was used to study exocytosis measured as changes in cell membrane capacitance.

In beta cells, biphasic exocytotic pattern was previously mainly attributed to insulin granule pool depletion. In paper I, we used the pulse length protocol and mixed-effect modelling; the latter takes care of cellular heterogeneity, to study exocytosis as a function of Ca2+ influx (measured as Q). The data suggests that pool depletion plays a minor role in observed biphasic exocytotic pattern in INS-1 832/13 cells; instead exocytosis is mostly determined by the kinetics of Ca2+ current inactivation. In paper II and III, we have investigated the effects of miRNA modulation on insulin secretion and exocytosis. First we investigated miRNA-regulation of voltage-gated Na+ channels since their role in beta cell function is not yet clear. Down-regulation of miR-375 differentially affected Na+ channel inactivation properties in INS-1 832/13 cells and miR-375 knock-out mice beta cells, suggesting species differences. As steady-state inactivation determines the number of channels available for generation of action potential, this study is a proof of principle that mir-375 could be important in regulating electrical activity in human beta cells. Next, miRNA-regulation of the exocytotic process was investigated. Overexpression of miR-335 reduced exocytosis and thereby insulin secretion through decreased expression of the exocytotic proteins STXBP1, SNAP25 and SYT11. In this paper I also made the novel observation that SYT11 increase basal insulin secretion and decrease rapid exocytosis, two phenomenons associated with T2D. The work on miR-335 emphasizes the importance of miRNAs in the regulation of the exocytotic process. In paper IV and V the effects of the cholesterol-lowering drug rosuvastatin was investigated. Rosuvastatin treatment dose dependently affected Ca2+ influx, exocytosis, basal and glucose-induced insulin secretion in INS-1 832/13 cells. Interestingly, most of this effect was though mevalonate pathway and not from the cholesterol lowering ability of rosuvastatin. In vivo rosuvastatin had an overall positive effect on glucose homeostasis in mice but negative effects on beta cell function such as disturbed Ca2+-signalling.

In conclusion, the data in my thesis demonstrate the need for investigations of the mechanisms behind defective insulin secretion and exocytosis in order to understand and treat T2D.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

När vi äter ökar nivån av blodsocker (blodglukos) i blodet. Glukos forslas i blodet till målvävnader, såsom fett och skelettmuskel, där det används som energi. Men för att glukos ska kunna tas upp av målvävnaden krävs insulin. Insulin är ett hormon som produceras av beta-celler i bukspottkörtelns Langerhanska öar, vars sekretion ut i blodet regleras av blodglukos. Då denna process misslyckas förmår inte kroppen att sänka blodglukos tillräckligt. Detta leder till utveckling av typ 2 diabetes, som är en kombination av beta-cellernas oförmåga att frisätta tillräcklig mängd insulin och målvävnadens oförmåga att ta upp glukos.

I denna avhandling har jag undersökt mekanismer som påverkar insulinsekretion och då framförallt en process som benämns exocytos. I beta-cellen fylls små runda blåsor, sk granula med insulin, då insulinet väl har producerats. Exocytos är den process varmed dessa granula smälter samman med det omgivande membranet på beta-cellen för att insulinet ska komma ut i blodet. Ökad koncentration av glukos är en grundläggande faktor för att exocytos ska ske och insulin utsöndras. Jag har specifikt fokuserat på tre faktorer som kan påverka exocytos-processen i beta-cellen och därmed också insulinsekretionen och nivån av glukos i blodet. Dessa är calcium, microRNA och rosuvastatin.

Kalcium är den molekyl som initierar fusionen av granula med det omgivande membranet. Jag har i min avhandling på detaljerad cellulär fysiologisk nivå med hjälp av en matematisk modell studerat detaljer i förhållandet mellan kalcium och fusionen av granula, som har medfört ökad förståelse för den här processen. En viktig del i denna studie är att jag tagit tillvara att enskilda celler är heterogena, något som inte tidigare gjorts i liknande studier.

MicroRNA är små molekyler som reglerar mängden av protein i cellen. Då en cell har mycket av ett microRNA så minskar mängden av protein som detta microRNA specifikt reglerar. Dessa molekyler har föreslagits kunna fungerar som biomarkörer då halten av specifika microRNA förändras vid uppkomst av sjukdom. MicroRNA är ofta vävnads-specifika och därför har reglering av mängden microRNA också förslagits kunna användas som läkemedel. Jag har studerat två microRNA, miR-375 och miR-335, och hur de reglerar mängden specifika protein, som påverkar sekretionen av insulin och exocytos-processen. I min avhandling fann jag att miR-375 reglerar beteendet hos en spänningskänslig jonkanal som forslar natrium in i cellen. Vidare fann jag att överuttryck av miR-335 påverkar mängden av tre olika protein som medverkar i exocytos-processen. Det sistnämnda är extra intressant eftersom det tidigare har visats att mängden miR-335 är förhöjd i diabetiska djurmodeller och mängden av flera proteiner som medverkar vid exocytos-processen är reducerad i Langerhanska öar vid typ 2 diabetes.

Rosuvastatin är en statin som används för behandling av kardiovaskulära sjukdomar för att sänka kolesterolnivån. På senare tid har det via flera studier framkommit att medicinering med statiner medför en ökad risk att få diabetes. För att undersöka detta närmare har jag i min avhandling undersökt hur rosuvastatin påverkar exocytos-processen, sekretion av insulin och blodglukosnivåer. Jag fann att rosuvastatin minskade insulinsekretionen och påverkade nivåerna av kalcium inne i cellen. Vidare hade rosuvastatin en positiv effekt på upptaget av glukos i målvävnad, och åtminstone under den period som vår studie pågick förändrades inte blodglukosnivåerna. Den minskade insulinsekretionen kan dock på längre sikt komma att öka glukoshalten i blodet. Detta får framtida studier visa.

Sammanfattningsvis visar jag i min avhandling vikten av en fungerade exocytos-process för fungerande sekretion av insulin. Genom denna kunskap har ytterligare en pusselbit lagts till det pussel som behöver läggas för att vi ska få en ökad förståelse av hur insulin utsöndras och hur defekter i denna process leder till typ 2 diabetes. Nödvändigt för en framtida förbättrad behandling av sjukdomen.



Popular Abstract in Uncoded languages

आपण जे काही खातो त्या मुळे रक्ता तील साखरे (ग्लुकोस) चे प्रमाण वाढते. शरीराला उपयुक्त अशा या साखरेचे परिवहन शरीराच्या विभिन्न भागात केले जाते; उदाहरणार्थ: चरबी, विविध स्नायू इत्यादी., जिथे तीचा वापर उर्जा स्त्रोत म्हणून केला जातो. परंतु ही साखर शरीरा मध्ये शोषून घेण्या साठी इन्सुलिन नावाच्या संप्रेरकाची गरज भासते. इन्सुलिन नावाचे हे संप्रेरक स्वादुपिंडा तिल बीटा पेशी द्वारे तयार केले जाते. इन्सुलिन चा रक्तातील प्रादुर्भाव हा शरीरातील साखरे च्या प्रमाणा वर अवलंबून असतो. मानवी शरीरातील हि एक सर्व सामान्य प्रक्रिया आहे, या प्रक्रिये मध्ये काही बिघाड झाल्यास, शरीर रक्तातील साखरेचे प्रमाण नियंत्रित करू शकत नाही. पुढे जाऊन याचे रुपांतर मधुमेह-प्रकार-२ नावाच्या आजारात होते. या आजारा मध्ये स्वादुपिंडा तील बीटा पेशी इन्सुलिन तयार करण्यास असमर्थ असतातच त्याच बरोबर शरीरातील स्नायू सुद्धा इन्सुलिन शोषून घेण्यास असमर्थ होऊन जातात.

प्रस्तुत शोधनिबंधा मध्ये; इन्सुलिन बनविण्याच्या सर्व सामान्य प्रक्रियेवर बाधा आणणारे घटक आणि विशेषत: एक्सोसायटोसीस (शरीरातील एक प्रक्रिया: ज्या द्वारे पेशी मधील घटक द्रव्य काही कारणास्तव पेशी बाहेर काढले जातात); या विषया वर मी संशोधन केले. बीटा पेशी मध्ये तयार झालेले इन्सुलिन, छोट्या फुग्या सारख्या आकारामध्ये साठवले जाते; त्याला इन्सुलिन चे गोळे असेही म्हणतात. त्या नन्तर एक्सोसायटोसीस च्या प्रेक्रीये द्वारे इन्सुलिन चे गोळे बीटा पेशी च्या बाह्य आवरणा तून पेशी च्या बाहेर रक्ता मध्ये सोडले जातात. शरीरा मध्ये अवास्तव वाढलेली साखर हे एक्सोसायटोसीस प्रक्रियेला चालना देणार आणि इन्सुलिन च्या निर्मितीला भाग पाडणार मूळ कारण आहे. माझ्या संशोधना मध्ये मी प्रामुख्याने तीन घटकांचा अभ्यास केला ते म्हणजे; कॅल्शियम, लघु-आर.एन.ए., रोसुवास्तातीन. कारण की या तीनही घटकांमध्ये; एक्सोसायटोसीस प्रक्रिया- त्यावर अवलंबून असणारी इन्सुलिन निर्मिती प्रक्रिया आणि रक्तातील साखरे च प्रमाण; या महत्वाच्या गोष्टी वर परिणाम करण्याची क्षमता आहे.

कॅल्शियम या पदार्था मुळे वेग-वेगळे गोळे सभोवतालच्या आवरणास चीकटन्यास मदत होते. मी गणिती पद्धतीने अभ्यास करून कॅल्शियम चे प्रमाण आणि इन्सुलिन चे गोळे यांच्या तील परस्परसंबंध विस्तृत पणे तपासला. विशेष म्हणजे या अभ्यासा मध्ये "प्रत्येक पेशी ही विभिन्न प्रकार ची असु शकते" हि गोष्ट विचारात घेण्यात आली. आमच्या माहिती प्रमाणे अशाप्रकारचा प्रयोग आम्हीच सर्व प्रथम करत आहोत.

लघु आर.एन.ए.: हे लहान असे पदार्थ पेशी मधील एखाद्या ठराविक प्रथिना चे प्रमाण कमी-जास्त करू शकतात. जर एखाद्या पेशी मध्ये एखाद्या ठराविक प्रथिन चे जास्त लघु आर.एन.ए. असतील तर ते त्या ठराविक प्रथिना ची संख्या कमी करतात. त्याच मुळे विशिष्ट आजाराशी संलग्न असलेल्या लघु आर.एन.ए चा वापर त्या विशिष्ट आजाराचे निदान करण्या साठी होऊ शकतो. लघु आर.एन.ए. सहसा विशिष्ट स्नायू साठीच कार्यरत असतात, म्हणूनच लघु आर.एन.ए. च्या प्रमाणा वर नियंत्रण मिळवून आपण त्याचा उपचार करण्या साठी वापर करू शकतो. मी; मीर-३७५ व मीर-३३५ हे दोन लघु आर.एन.ए. तपासले, हे दोघे एखाद्या प्रथिना च्या निर्मिती मध्ये कसा व्यवहार करतात? ज्याच्या मुळे इन्सुलिन च्या एक्सोसायटोसीस

प्रक्रिये वर परिणाम होत असावा. या संशोधना मध्ये मला असे आढळून आले कि मीर-३७५ हा विधुतदाबाला संवेदनशील असणाऱ्या सोडीअम आयन चानेल चे नियमन करतो. अधिक संशोधना मध्ये मला असेही आढळून आले कि मीर-३३५ हा एक्सोसायटोसीस प्रक्रिये शी संलग्न असलेल्या तीन प्रथिनांचे नियमन करतो. आधी च्या प्रयोगा मध्ये शास्त्रद्नानांनी दाखवले आहे कि प्रयोग शाळेतील मधुमेहाच्या मोडेल प्राण्यान मध्ये मीर-३३५ चे प्रमाण हे वाढलेलच असते. हा निकाल माझ्या संशोधनाला पूरकच म्हणता येईल.

रोसुवास्तातीन : हे एक हृदयविकार च्या उपचारासाठी वापरण्यात येणार औषध आहे. बाकीच्या शास्त्राद्नांनी आधी केलेल्या अभ्यासात आढळून आलय कि या औषधा च्या वापरामुळे मधुमेह-प्रकार-२ होऊ शकतो. माझ्या अभ्यासात, रोसुवास्तातीन कशा प्रकारे एक्सोसायटोसीस प्रक्रिया- त्यावर अवलंबून असणारी इन्सुलिन निर्मिती प्रक्रिया आणि रक्तातील साखरेच प्रमाण इत्यादी वर कशा प्रकारे परिणाम कारक आहे हे पाहण्यात आले. रोसुवास्तातीन मुळे पेशी मधील इन्सुलिन निर्मिती कमी झाली आणि कॅल्शियम चे प्रमाण सुद्धा बदलले. त्या शिवाय रोसुवास्तातीन मुळे विशिष्ट स्नायू मधला साखरेच प्रमाण हि वाढल आणि टिकवून राहील. निष्कर्ष: माझ्या अभ्यासातून मी; एक्सोसायटोसीस चे इन्सुलिन निर्मिती मध्ये असणारे महत्व दाखवून दिले. विस्तारितस्वरूपामध्ये केलेल्या या अभ्यासातून इन्सुलिन निर्मिती प्रक्रिया, त्या मध्ये येणार्या अडचणी मुळे मधुमेह-प्रकार-२ होण्याची शक्यता इत्यादी गोष्टी लक्षात आल्या. हा अभ्यास भविष्यामध्ये मधुमेहा वरिल उपचार पद्धती विकसित करण्यास निश्चितच उपयुक्त ठरेल.

• author: Salunkhe, Vishal Ashok
• supervisor: Lena Eliasson; Anna Wendt; Jonathan Esguerra; Jenny Vikman
• opponent: Professor Thurmond, Debbie, Department of Molecular and Cellular Endocrinology, Diabetes Institute City of Hope, Duarte, CA, USA
• organization: Diabetes - Islet Cell Exocytosis (research group); EXODIAB: Excellence of Diabetes Research in Sweden
• publishing date: 2015
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Endocrinology and Diabetes
• keywords: Type 2 diabetes, exocytosis, Ca2+, miR-375, miR-335, rosuvastatin, voltage-gated Na+ channels, STXBP1, SNAP25, SYT11, glucose homeostasis, beta cell function
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2015:135
• pages: 79 pages
• defense location: Jubileumsaulan, MFC, Jan Waldenströms gata 1, Malmö
• defense date: 2015-12-11 13:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-7619-215-3
• language: English
• LU publication?: yes
• id: fc312bbb-2383-4c07-a28f-cedb5b8d59eb (old id 8194837)
• date added to LUP: 2016-04-01 13:16:28
• date last changed: 2019-05-21 21:39:17