Injury-Induced Signalling in Arterial Smooth Muscle Cells

Abstract

The vascular wall is an active, elastic and integrated organ made up of cellular and extracellular matrix (ECM) components. It is not a static organ; the components dynamically change and reorganize in response to physiological and pathological stimuli. Vascular injury induces a complex healing process, analogous to generalised wound healing. Subsequent to the inflammatory response, proliferation and migration of smooth muscle cells (SMCs) is initiated as well as reorganisation of the ECM. The primary function of SMCs in the normal media is contraction, and to be able to migrate and proliferate they must first change their phenotype.



This thesis focuses on the underlying molecular mechanism involved in the SMC response to injury. The understanding of these mechanisms enables us to understand the overall SMC function in the vessel. It is based on signalling and extracellular matrix events following injury to cultured arterial smooth muscle cells. In the first paper, the cytotoxic effects of 7beta-hydroxycholestrol are characterized. We show that this natural compound induces Ca2+ oscillations, ERK1/2 activation followed by apoptosis in SMCs. In the next two studies, we analysed the involvement of ERK1/2 in SMC responses to mechanical injury. In paper II, intracellular Ca2+ release and tyrosine kinase activation was investigated. Immediately after injury, Ca2+ is released from thapsigargine sensitive Ca2+-pools and subsequent ERK1/2 phosphorylation is initiated. Our data indicate that injury-induced DNA synthesis is dependent on immediate phosphorylation of ERK1/2, and probably other tyrosine kinases, whilst the injury-induced migration is dependent on later phosphorylation events. Paper III suggests that osteopontin, a glycoprotein in the ECM, is a downstream target of ERK1/2 signalling.



We found in paper IV that one part of the immediate SMC response-to-injury to be a generation of a novel dermatan sulphate-containing complex. Our data indicates that this mitogenic complex is formed/released from the ECM/cells as a response to injury. Due to the dermatan sulphate involvement in such a complex, this thesis last part describes biosynthetic differences between SMC phenotypes with regard to their proteoglycan profile.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Cirka hälften av dödsfallen i västvärlden orsakas av hjärt-kärlsjukdomar såsom hjärtinfarkt, kärlkramp och stroke. En gemensam nämnare för dessa är den bakomliggande sjukdomen <i>ateroskleros</i> (åderförkalkning eller åderförfettning). Ateroskleros är en inflammatorisk sjukdom, som leder till förträngningar (plack) av blodkärl. En orsak till detta är att blodfetter fastnar i kärlväggen. Mångårig forskning har identifierat flera riskfaktorer, till exempel höga kolesterolvärden, högt blodtryck, diabetes, bakteriella infektioner, rökning, stress samt ärftlig belastning. I många fall räcker inte förändrad livsstil, utan patienternas förträngda blodkärl måste vidgas med hjälp av kirurgi. En metod är så kallad by pass-operation, då ett nytt kärl opereras in över det förträngda området. En annan är ballongvidgning, då en ballong förs in i kärlet och spränger bort förträngningen. En nackdel med metoden är att kärlväggen uppfattar sig som skadad och startar sin inneboende läkningsprocess/reparationsprocess. Cirka en tredjedel av de patienter som behandlats med ballongvidgning drabbas på detta vis av <i>restenos</i>, en ny förträngning av kärlet, inom sex månader. En av orsakerna till restenos är att kärlets glatta muskelceller aktiveras: de ökar i antal (prolifererar), vandrar (migrerar), producerar signalämnen samt utsöndrar fler, och ibland förändrade, bindvävskomponenter.



På cell- och molekylnivå.



Muskelcellernas roll i blodkärlen är att reglera blodtryck och blodflöde. Studeras normala celler med elektronmikroskop ser man att de är fyllda av filament, proteintrådar som reglerar cellens kontraktion. En aktiverad cell ser helt annorlunda ut. Dess inre är nu fyllt av det maskineri som krävs för produktion av de nya proteiner den aktiva cellen behöver. Denna förändring av funktion och utseende, benämns fenotypisk förändring.



Celler kommunicerar med varandra via utsöndring av tillväxtfaktorer eller via direkt kontakt med intilliggande celler eller bindväv. Kommunikationen regleras av ett mycket komplext nätverk av signalvägar, där specialiserade proteiner och joner ingår. Ett sådant signalprotein ERK1/2 (extracellulärt reglerat kinas) kan aktiveras av olika signaler, och är framförallt inblandat i celldelning och förflyttning. På senare år har det även visats att aktivering av ERK1/2 kan leda till apoptos (programmerad celldöd). En annan signalförmedlare är kalciumjoner (Ca2+), vilka finns koncentrerade i olika förråd inne i cellerna samt i hög koncentration utanför cellerna. Hur cellen ska reagera på en hastigt ökad mängd fria kalciumjoner, avgörs bland annat av på vilket sätt Ca2+ frisatts.



En familj av bindvävsmolekyler är proteoglykaner. De består av ett protein, med en eller flera sockerkedjor (glykosaminoglykaner) fästa vid sig. En generell egenskap hos dessa laddade molekyler är att de kan binda andra bindvävsmolekyler och tillväxtfaktorer. Vid behov kan cellerna förändra sammansättningen av proteoglykanernas sockerkedjor, medan proteinet är detsamma. Olika proteiner har olika egenskaper, på samma sätt har olika sockerkedjor olika egenskaper.



Idag används olika försöksdjursmodeller för att studera olika typer av kärlskada (t.ex. inflammatorisk, toxisk eller mekanisk). Även om dessa är mycket användbara när det gäller att karaktärisera aktiveringen av glatta muskelceller efter skada, så är det inte möjligt att studera enbart denna celltyp. Därför har vi använt oss av glatta muskelceller isolerade från råttaorta, så kallad primärkulturs-odling, samt en human glatt muskelcell-linje. Med hjälp av cell- och molekylärbiologiska metoder har det varit möjligt att detalj analysera signalkaskader och aktivering av glatta muskelceller i samband med skada.



Muskelcellers reaktion på toxisk skada.



I det första delarbetet har vi karaktäriserat hur humana glatta muskelceller reagerar på skada i form av 7beta-hydroxykolesterol, en naturligt förekommande form av kolesterol. Cellernas omedelbara reaktion är att frisätta Ca2+ ifrån sina förråd och aktivera signalmolekylen ERK1/2. Efter något dygn identifierades apoptotiska celler, det slutliga svaret på tillförsel av denna form av kolesterol. Om cellerna samtidigt behandlas med inflammatoriska signalsubstanser, ökar andelen apoptotiska celler. Detta visar att en inflammatorisk miljö, till exempel i ett aterosklerosiskt plack, ökar den skadliga effekten av 7beta-hydroxykolesterol.



Muskelcellers svar på mekanisk skada.



I de tre följande arbeterna har vi analyserat hur glatta muskelceller reagerar på mekanisk skada. Vår målsättning var att finna signalvägar som är inblandade i det system som gör det möjligt för cellerna att dela och förflytta sig efter mekanisk skada. Vi visar att kalcium omedelbart frisätts ifrån intracellulära kalciumförråd, som är känsliga för drogen thapsigargin. Celler som behandlats med denna drog innan de skadats har lägre benägenhet att dela och förflytta sig, jämfört med obehandlade celler. Utöver detta fynd visas att aktivering av ERK1/2 krävs för flyttning och delning. Andra forskargrupper har visat att ERK1/2 kan aktiveras i flera vågor efter stimulering. Vi visar med hjälp av en drog som förhindrar aktivering av ERK1/2 att celldelningen är beroende av signalering via ERK1/2 omedelbart efter skada, medan cellerna förmåga att röra sig är beroende av en senare ERK1/2-signalering. I det tredje delarbetet har vi studerat uttrycket av osteopontin, ett bindvävsprotein som det har hittats höga halter av i aterosklerosiska plack. Osteopontin kan även stimulera förflyttning av glatta muskelceller. Vi visar i detta arbete att uttrycken av osteopontin mRNA och protein ökar efter skada, och att ökningen är ERK1/2 beroende.



Proteoglykaner.



I djurmodeller har det visats att tillväxtfaktorer bildas och frisätts inom några dagar som svar på en skada. Vi frågade oss om cellerna i vårt modellsystem frisätter signalmolekyler omedelbart efter skada. Delarbete fyra beskriver ett komplex som frisätts omedelbart efter skada och att det är ansvarigt för aktivering av glatta muskelceller. Vi visar att detta komplex innehåller dermatansulfat, en sorts sockerkedja som finns hos en familj av proteoglykaner. Klyvs sockerkedjan, förloras den aktiverande förmågan hos komplexet. I avhandlingens sista delarbete har vi kartlagt proteoglykanuttrycket hos fenotypiskt förändrade glatta muskelceller. Den aktiva cellen producerar mer proteoglykaner, och det finns skillnader i sockerstrukturen jämfört med proteoglykaner ifrån filament fyllda celler.



Sammanfattningsvis, ERK1/2 är en mycket viktig signalmolekyl inne i cellen. Den påverkar glatta muskelcellers svar på skada på olika nivåer. Vi visar att proteoglykanprofilen från aktiverade glatta muskelceller skiljer sig ifrån vilande celler, samt att dermatansulfat är inblandat i den omedelbara aktiveringen av glatta muskelceller efter mekanisk skada.

• author: Moses, Sara
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: MD PhD Hedin, Ulf, Department of Surgical Sciences, Karolinska Hospital, Stockholm, Sweden
• organization: Department of Experimental Medical Science
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Basic Medicine
• keywords: GAG, Clinical biology, Klinisk biologi, proteoglycan, osteopontin, ERK, MAPK, signalling, smooth muscle cell, injury
• pages: 128 pages
• defense location: GK-salen, BMC, Lund. 13.00
• defense date: 2002-04-18 10:15:00
• ISBN: 91-628-5141-1
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. 7beta-hydroxycholesterol induces Ca2+ oscillations, MAP kinase activation and apoptosis in human aortic smooth muscle cells.Ares, M. P., Porn-Ares, M. I., Moses, S., Thyberg, J., Juntti-Berggren, L., Berggren, P., Hultgårdh-Nilsson, A., Kallin, B. and Nilsson, J. (2000). Atherosclerosis. 153(1): 23-35. Article: II. Smooth muscle cell response to mechanical injury involves intracellular Calcium release and ERK1/ERK2 phosphorylation.Moses, S., Dereja, K., Lindkvist, A., Lövdahl, C., Hellstrand, P. and Hultgårdh-Nilsson, A. (2001). Experimental Cell Research. 269: 88-96. Article: III. Injury-induced osteopontin gene expression in rat arterial smooth muscle cells is dependent on Mitogen-activated protein kinases ERK1/ERK2.Moses, S., Franzén, A., Lövdahl, C. and Hultgårdh-Nilsson, A. (2001). Arch Biochem Biophys. 396(1): 133-7. Article: IV. Injury to arterial smooth muscle cells releases a complex with mitogenic activity. Proposed glycosaminoglycan participation.Moses, S., Moses J, and Hultgårdh-Nilsson A. (2002). Manuscript Article: V. Biglycan is increased during phenotypic modulation of rat aortic smooth muscle cells.Todorova, L., Moses, S., Eklund, E., Hultgårdh-Nilsson, A. and Malmström, A. (2002). Manuscript
• id: 908b283a-7fb5-4001-8170-9c067a0ef4e8 (old id 464463)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:17:01
• date last changed: 2018-11-21 20:57:53