Neuronal and glial differentiation of expanded neural stem and progenitor cells; in vitro and after transplantation.

Abstract

In this thesis we have used cells dissected from the lateral ganglionic eminence (LGE), the medial ganglionic eminence (MGE), and the cortical primordium of the embryonic mouse forebrain. The tissue was dissected from either i) wild-type mice, ii) green fluorescent protein (GFP)-, or iii) Gtv-a-expressing transgenic mice, and subsequently grown and expanded in vitro using two different protocols. Cells were either plated and extensively expanded as attached glial cultures in the presence of epidermal growth factor (EGF) and serum, or expanded in the presence of EGF and basic fibroblast growth factor (bFGF) as free-floating aggregates termed neurospheres. The attached LGE-derived cells were expanded for more that 7 months (25 passages), and the cells expressed neural stem-/progenitor markers, such as glial fibrillary acidic protein (GFAP), nestin, RC2 and M2/M6, both at early and late passages. We demonstrated that the repeatedly passaged attached glial cultures derived from either the LGE or MGE (but not the cortical primordium) were capable of generating significant numbers of neurons and glial cells at differentiating conditions, i.e. after removal of EGF and serum from the expansion medium. By using a transgenic approach, we were able to show that at least a subset of the newly generated neurons and oligodendrocytes were derived from GFAP-expressing cells. Interestingly, the newly generated neurons were found to retain some of their region-specific expression even after extensive in vitro-expansion. After grafting of the expanded attached LGE-derived cells, we found that they were able to integrate into both the adult (intact and lesioned) and neonatal rat striatum, as visualized with the mouse-specific astroglial marker M2. However, even though these cells had the capacity to differentiate into neurons and glial cells in vitro, we were only able to detect few neuron-like cells after transplantation. Instead these cells expressed almost exclusively an astroglial phenotype after implantation. Moreover, we showed that cells from expanded neurosphere cultures, derived from the LGE, MGE and cortical primordium of the embryonic GFP-transgenic mouse, had the capacity to differentiate into morphologically fully mature neurons, as well as astrocytes and oligodendrocytes after transplantation, as visualized with the species-specific marker M2 and the reporter gene GFP. These results demonstrated the ability of mouse derived neural stem-/progenitor cells expanded in vitro as neurospheres to generate both neurons and glia after transplantation into neonatal recipients, and differentiate into mature neurons with morphological features characteristic for each target site. Altogether, the results of the present thesis demonstrate a capacity of cells derived from the mouse embryonic forebrain to be long-term expanded using two different protocols, and that the cells have the potential to differentiate in vitro and give rise to progeny with at least some region-specific characteristics retained. The cells can also survive and integrate into the host tissue after transplantation. However, mainly cells grown as neurospheres displayed the potential of neuronal differentiation after implantation into the neonatal graft host. A lot of experimental work is still needed in order to understand and control the mechanisms for growth and differentiation of neural stem-/progenitor cells before such cells can be applied in other studies, such as in clinical trials towards treatment of for example neurodegenerative disorders.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Denna avhandling handlar om stam- och progenitorceller från den embryonala mushjärnan. Jag har studerat dessa cellers förmåga att växa in vitro (utanför kroppen) samt efter transplantation till hjärnan hos vuxna och nyfödda råttor. Forskning om stamceller har länge varit ett populärt och uppmärksammat forskningsområde, men under de senaste åren har intresset i det närmaste eskalerat. Vad är då stamceller? Jo, stamceller är multipotenta celler med kapacitet att dela sig och ge upphov till olika celler inom den vävnad de befinner sig i. Stamcellerna i hjärnan kan dela sig på två olika sätt. Dels genom symmetrisk celldelning då de ger upphov till två nya identiska kopior, samt asymmetriskt då en identisk stamcell och en dottercell med ett förutbestämt öde bildas. Dottercellen kallas för progenitorcell och är en något mer specificerad cell jämfört med en stamcell. Progenitorcellerna i hjärnan kan dela sig under en kort tidsperiod för att ge upphov till antingen en nervcell eller en stödjecell, sk gliacell. Gliaceller är ett begrepp i det centrala nervsystemet som innefattar astrocyter, oligodendrocyter, mikroglia och ependymalceller. I den embryonala hjärnan befinner sig stamcellerna i ett område runt ventrikeln som benämns ventrikulärzonen. Här delar sig stamcellerna och ger upphov till respektive progenitorcell. När progenitorcellerna har genomgått sin sista celldelning, migrerar de ut i hjärnan till den plats där utmognad till en funktionell cell sker. Inom fältet diskuteras mycket kring vilken cell i hjärnan som är den sanna stamcellen och nyligen presenterades data från olika forskargrupper som föreslår att det är den så kallade radialgliacellen som är den egentliga stamcellen. Denna celltyp finns bara under embryots utveckling och har en specifik bipolär morfologi med cellkroppen belägen i ventrikulärzonen och ett radialutskott som sträcker sig nedåt mot ventrikeln, samt ett uppåt mot hjärnhinnan. Radialgliaceller uttrycker vissa specifika markörer, både kända stam-/progenitorcellmarkörer och gliamarkörer. Radialgliacellerna delar sig under hjärnas utvecklingsfas och ger då upphov till nervceller under nervcellsbildningen (neurogenesen), vilken sker tidigt i hjärnans utveckling. Dessa celler låter även nybildade nervceller klättra på radialutskotten till sina platser ute hjärnbarken. När neurogenesen är över, delar sig radialgliacellerna en sista gång för att ge upphov till astrocyter. Trots tidigare hypoteser om att neurogenesen avtar efter födseln, har det på senare år visat sig att nybildning av nervceller sker i specifika regioner av den vuxna hjärnan. Dessa nybildade celler tros härröra från stamceller i den vuxna hjärnan som föreslagits vara GFAP (glial fibrillary acidic protein)-uttryckande astrocyter. Ett mål med stamcellsforskning är att studera och lära känna dessa celler så pass väl, att det finns en möjlighet att i framtiden eventuellt kunna använda stam-/progenitorceller vid tex transplantationer till patienter med neurodegenerativa sjukdomar. Stamceller skulle då på olika sätt kunna fungera terapeutiskt, dels genom att direkt ersätta de skadade cellerna i hjärnan eller genom att tillföra ämnen som saknas i den skadade hjärnan med sk ex vivo genterapi, dvs efter viss behandling av cellerna in vitro. För att karaktärisera cellers potential kan de studeras i cellkultur (in vitro) och/eller efter transplantation (in vivo). I denna avhandling har vävnad och celler från både vildtyp och transgena möss använts. Stam- och progenitorceller, sk precursorer, dissekerades ut från tre specifika områden i den embryonala mushjärnan: dels de laterala och mediala ganglionära eminencerna (LGE och MGE), som tillsammans bildar striatum och delvis medverkar till bildning av interneuron i luktbulben, hjärnbarken, och hippocampus. Vi isolerade även celler från den del av hjärnan som efter utvecklingen kommer att ge upphov till största delen av hjärnbarken. Celler odlades på två olika sätt in vitro, dels som fastsittande gliakulturer i närvaro av serum ochtillväxtfaktorn EGF (epidermal growth factor) och dels som friflytande aggregat sk. neurosfärer, i närvaro av EGF och bFGF (basic fibroblast growth factor). Vi fann att dessa precursorer kan bibehållas i kultur under väldigt lång tid och att de även har möjlighet att vid ändrade växtförhållanden ge upphov till nervceller, astrocyter och oligodendrocyter. Vi kunde även visa att de nybildade nervcellerna som bildas i kulturerna, till viss del bibehöll vissa regionspecifika markörer efter expansion i kultur. Med hjälp av transgena celler visade vi vidare att några av de nyblidade nervcellerna hade genererats av GFAP-uttryckande celler, vilket betyder att GFAP-uttryckande gliaceller har viss stam-/progenitorcell kapacitet in vitro. Cellernas förmåga till integrering, migration och differentiering in vivo, studerades genom transplantation av dessa celler till vuxna och nyfödda råttor. Att transplantera celler från mus till råtta underlättar arbetet med att hitta cellerna efter transplantation, då man kan använda sig av art-specifika markörer vid detektionen. Använder man dessutom vävnad eller celler från en transgen mus kan denna transgen också användas som markör vid detektion av cellerna efter transplantation. I denna avhandling har vi använt oss av den art-specifika markören M2, och reportergenen GFP (green fluorescent protein). De fastsittande gliakulturerna från LGE transplanterades till striatum på vuxna och nyfödda råttor. Fyra veckor efter transplantation såg vi att cellerna hade överlevt och integrerats i värdhjärnan. Men trots att dessa celler uppvisade en neuronal differentieringskapacitet i kultur, fann vi nästan uteslutande celler med astrocytkaraktär efter transplantation. När celler från neurosfärskulturerna transplanterades till striatum, hippocampus och cortex på nyfödda råttor, fann vi dock att de bibehöll sin differentierings-kapacitiet även efter transplantation. Neurosfärerna gav till största del upphov till astrocyter, men även till ett signifikant antal nervceller och oligodendrocyter in vivo. De nygenererade nervcellerna från LGE neurosfärerna, uppvisade projektioncells-och interneurons-morfologi i striatum, samt interneurons-morfologi i luktbulben och hippocampus, vilket avspeglar den normala utvecklingen av stam- och progenitorceller från just LGE. Cellerna, till största del astrocyterna, uppvisade även viss migrations kapacitet efter transplantation till striatum. Dessa resultat visar att precursorceller som expanderas i kultur, speciellt neurosfärer, har förmåga att generera nervceller och gliaceller efter transplantation till nyfödda råttor, och att de dessutom kan utmogna till nervceller med rätt morfologi för den region i hjärnan som cellen transplanteras till. Till sist kan det nämnas att resultaten som presenteras i denna avhandling demonstrerar i sin helhet att celler genererade från den embryonala mushjärnan innehar kapacitet att expanderas under lång tid och dessutom utmogna till nervceller och gliaceller i kultur. Vidare även att de nygenererade nervcellerna till viss del behåller sina uttryck av regionspecifika markörer efter expansion i kultur. Vi kunde även visa att cellerna överlever efter transplantation till den nyfödda och till viss del även den vuxna råtthjärnan. Efter transplantation gav framförallt de celler som odlats som friflytande neurosfärer upphov till ett signifikant antal nervceller, astrocyter och oligodendrocyter i den nyfödda råtthjärnan. Trots den uppvisade kapaciteten av dessa celler krävs det fortsatt mycket arbete för att kunna förstå och kontrollera mekanismerna för tillväxt och differentiering av dessa precursor- celler innan forskningen kan fortsätta mot sådana mål som tex användning av liknande celler i kliniska studier.

• author: Eriksson Linsmeier, Cecilia
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Svendsen, Clive N
• organization: Neurobiology (research group)
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Neurosciences
• keywords: Gtv-a, RCAS(A)-EGFP, transplantation, cell detection, Neurology, neuropsychology, neurophysiology, Neurologi, neuropsykologi, neurofysiologi, GFP-actin, glial differentiation, neuronal differentiation, neurospheres, glial cultures, bFGF, EGF, cell expansion, cortical primordium, MGE, LGE, CNS, stem-/progenitor cells
• pages: 151 pages
• defense location: Segerfalksalen, WNC, BMC A11, Lund
• defense date: 2003-05-27 10:15:00
• ISBN: 91-628-5666-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Cecilia Eriksson, Cecilia Ericson, Monte A. Gates and Klas Wictorin (2000),Long-term, EGF-stimulated cultures of attached GFAP-positive cells derived from the embryonic mouse lateral ganglionic eminence: in vitro and transplantation studies.Experimental Neurology, July 164(1):184-199. Article: II. Cecilia Eriksson, Anders Björklund and Klas Wictorin (2003),Neuronal differentiation following transplantation of mouse neurosphere cultures derived from different embryonic forebrain regions.Submitted (Experimental Neurology) Article: III. Charlotta Skogh, Cecilia Eriksson, Merab Kokaia, Xia C. Meijer, Lars U. Wahlberg, Klas Wictorin and Kenneth Campbell (2001),Generation of regionally specified neurons in expanded glial cultures derived from the mouse and human lateral ganglionic eminence.Molecular and Cellular Neuroscience, May 17(5):811-820. Article: IV. Cecilia Eriksson and Klas Wictorin (2003),Neuronal and glial differentiation within expanded glial cultures derived from the lateral and medial ganglionic eminences.Manuscript
• id: 988d4f8e-a8fa-4251-bff2-d375a7c3ed8c (old id 465688)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:23:55
• date last changed: 2018-11-21 21:10:43