The estrogen receptor in fish and effects of synthetic estrogens in the environment - Ecological and evolutionary perspectives and societal awareness

Abstract

Synthetic hormones are a group of pharmaceuticals used for various human and animal treatments. However, consumption and disposal of these substances have also given rise to negative effects and environmental problems for organisms in the wild which is why these substances have been classified as estrogenic endocrine-disrupting chemicals (EDCs). Studies on the estrogen receptors (ers) and their genes are of particular interest when investigating emerging negative effects from estrogenic EDC contaminants. In vertebrates, the ers are well conserved between organisms and regulate activation and deactivation involved for example in growth, reproduction and development in both males and females. The initial aims of my research presented in this thesis were to show how the duplicated er genes in vertebrates, by studying fish and salmonid species in particular, are distributed, activated or disrupted by both ecological and pharmaceutical challenges. I have worked with three different fish species: Atlantic salmon (Salmo salar); brown trout (Salmo trutta); and roach (Rutilus rutilus) sampled from natural populations in the wild. I show that there is a complex interaction between estrogens and its receptors, depending on which tissues and life stages are investigated. I have also identified multiple ers in salmonids, which could affect their sensitivity to EDC exposure. In the framework of how 17α-ethinylestradiol (EE2) affects fish and the environment we linked exposure of EE2 to changes in behavior and gene expression and as such the consequences it might have for the structure and function of an ecosystem. Because of the recent focus on technical solutions for the removal of pharmaceutical EDCs in the environment a complementary aim was to investigate whether increased knowledge regarding the disposal and usage of EDCs, so called upstream work, could lower use of and prescriptions for the human female contraception EE2. For this I assessed the societal awareness among the main prescribers and decision makers in Sweden on the negative effects release of EE2 has on the environment. I show that providing nurse midwives with more knowledge and information about the negative consequences synthetic hormones have on ecosystems could lead to changes in their consultations practices and their prescriptions of EE2. This, in combination with updated recommendations regarding norms and practice for safe contraceptive care from authorities, could in the future help lower EE2 residues in the environment in the future. To conclude, this thesis identifies key factors for understanding how EDCs affect organisms. I show that ers vary in expression between both life stages and between tissues and that this should be considered when estimating risks for organisms after EDC exposure. This thesis also opens up a new and hitherto unappreciated field in the work surrounding the upstream knowledge and EDCs.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vår läkemedelsanvändning har eskalerat de senaste två årtionden och vi har kunnat behandla, bota och förebygga sjukdomar samt minskat antalet oönskade graviditeter i större utsträckning jämfört med förr. Detta har dock också fört med sig negativa effekter och miljöproblem efter att läkemedlen kommer ut i naturen. Ett antal läkemedel är så kallade endokrina störningssubstanser (EDC), där de mest kända är de hormonella preventivmedlena. De innehåller kemikalier som liknar våra egna hormoner men kan också reagera med hormonsystem i andra djur. Det kan på så sätt ge indirekt effekter på hela ekosystemet i form av ändrat beteende och fortplantningssvårigheter i främst fisk. Att studera östrogenreceptorn (er) och dess gener är speciellt intressant när man undersöker de negativa effekterna från föroreningar av endokrina störningssubstanser. I ryggradsdjur är det hormonella systemet där östrogenreceptorn och dess gener ingår konserverade och ser ungefär likadana ut, de reglerar aktivering och stänger av en rad olika hormonella signaler som är inblandade i exempelvis tillväxt, reproduktion och utveckling i både honor och hanar. EDC är kända för att förändra fitnessen för en individ genom förändringar i tillväxt, beteende och reproduktion. En av de mest kända endokrina störningssubstanserna är 17α-ethinylestradiol (EE2), ett av de två verksamma ämnena i hormonella preventivmedel som finns framförallt i p-piller. Det är designat att efterlikna det egenproducerade östradiol (E2), ett av tre östrogener, och har samma funktion, i detta fall att hindra ägglossning och på så vis graviditet. Efter konsumtion av ex. p-piller spolas resterna ut i avloppet, genom reningsverken och därefter ut i våra akvatiska miljöer. Tekniska lösningar för att hantera utsläpp i miljön håller på att utvecklas och testas, men tekniska lösningar har också kostnader och själva källan till utsläppet, användningen av hormonella preventivmedel, hanteras aldrig. Tekniska lösningar i kombination med kunskap kring hanteringen av avfall och användning, så kallat uppströmsarbete, kan sänka halterna av EE2 och andra hormonella rester.

I min avhandling har jag undersökt östrogenreceptorernas gener och effekterna av EE2 från ett ekologiskt och evolutionärt perspektiv och börjat titta på hur medvetet samhället är om EE2s effekter i miljön genom att göra en studie med barnmorskor. Jag har studerat tre olika fiskarter, lax, öring och mört, från naturligt vilda populationer. Laxfamiljen är ekonomiskt viktiga fiskar som återfinns både i sött- och saltvatten på grund av vandring. Effekterna av EE2 är välstuderade hos mörten och återfinns i de flesta europeiska sötvatten.



Det hormonella systemet är konserverat i alla ryggradsdjur och alla ryggradsdjur har minst två östrogenreceptorer. Det är ett gammalt konserverat system då östrogen och dess receptorer styr många fler funktioner i kroppen än det kända kvinnlig könsmognad och fortplantning. I fisk hittar man ofta fler gener och receptorer på grund av deras evolutionära historia. I mört, som hos de flesta fiskar, hittar man tre olika östrogenreceptorer medan laxfiskar har fyra genetiskt olika receptorer. Antalet receptorer har uppkommit genom en kopiering av hela arvsmassan hos deras förfäder. Efter en kopiering av arvsmassan inträffar det tre olika scenarion; kopior försvinner (det vanligaste), kopian får en ny funktion eller de två kopiorna delar på den föregångares funktion. Det finns således en anledning till att fiskar har behållit tre olika östrogen receptorer och laxfiskar fyra (erα1, erα2, erβ1 och erβ2) men idag vet vi inte riktigt varför. För ca 88 miljoner år sedan, vilket i evolutionära sammanhang anses relativt nyligen, genomgick laxfiskars (lax, öring, röding, regnbåge) förfader en kopiering av hela genomet och i praktiken skulle de kunna ha åtta olika östrogen receptorer. Resultaten från min avhandling säger att man kan förvänta sig att hitta fyra olika östrogenreceptorer i alla laxfiskar. De genetiska koderna är väldigt lika och de är grupperade två och två varav erα2 är den som har uppkommit från den laxspecifika kopieringen.



En gen kan finnas i genomet men inte uttryckas i olika vävnader och kallas då tyst gen. Det finns gener som uttrycks men inte har någon funktion och dessa gener brukar inte ändra sin koncentration i olika vävnader eller under olika förhållanden. I andra fall finns det gener som uttrycks och som även har en funktion. Jag har i min avhandling undersökt hur mycket av de olika östrogenreceptorerna som uttrycks i olika vävnader i vandrande ung öring, så kallad smolt, och jämfört med ung öring som inte vandrar, i vuxen lax som vandrar tillbaka för lek och vuxen lax som lever ute i havet samt i mört som håller på att utvecklas från romkorn och exponeras för EE2. Vanligast studerar man hur östrogenreceptorn uttrycks i levern och äggcellerna, detta är vävnader som är aktiva i fortplantning. Det var också i levern man först hittade erα1 i fisk. Jag studerade även andra vävnader såsom gälar, mjälte, hjärna och hjärta. Detta beror på att östrogen har flera funktioner än fortplantning och vid exponering av endokrina störningssubstanser vet vi inte om det är flera funktioner som påverkas. Man är inte säker på den exakta mekanismen i de olika vävnaderna men misstänker att det rör sig om liknande som i däggdjur. I däggdjur har erα specialiserat sig i en del vävnader medan erβ finns i de allra flesta och man spekulerar att det är så att erβ har en roll i immunförsvaret. Man vet att erα1 i levern hos fisk är relaterade till produktionen av äggule-proteinet (gulkroppsämne) hos fisk. Jag visar att det i laxfiskar är svårt att säga att uttrycket är distribuerat såsom i däggdjur. Det som är tydligast i den här avhandlingen, vad gäller uttryck, är att erα2 finns främst i hjärnan och med en mindre roll i mjälten då vi exempelvis inte hittar något uttryck av erα2 i mjälten hos vuxna laxar (Paper I). Erα1 och erβ2 har väldigt lika uttrycksmönster och uttrycks i höga koncentrationer i lever. Det är möjligt att dessa två följer teorin som finns hos däggdjur, att erβ kan reparera skador, där erα har en specifik funktion. Erβ1 uttrycktes i höga halter i romkornen hos mört och kan ha en funktion i utveckling (Paper III). Det verkar också generellt som att vandrande fisk, i jämförelse med individer som inte vandrar, uttrycker lägre koncentrationer av östrogenreceptorn i alla vävnader förutom i levern (Paper II). Men varför fisk och speciellt laxfiskar har kvar fyra östrogen receptorer och vilken faktisk funktion de har är fortfarande okänt.

Tvåkönade fiskar, förändrat genuttryck, förhöjda nivåer av gulkroppsämne i blodet och förändringar i könsorganen som slutligen kan leda till att en fiskpopulation försvinner. Alla dessa förändringar har noterats även vid låga koncentrationer av EE2 i vatten. Fisk är ett ryggradsdjur och tar upp partiklar som befinner sig i vattnet via skinn, gälar och mat. Ett ämnes påverkan på en organism beror på upptaget, koncentrationen och dess funktionalitet. I EE2s fall är det främst vattenlevande ryggradsdjur som påverkas då utflödet är kontinuerligt i låga men väldigt potenta koncentrationer. I min avhandling visar jag på att det finns genförändringar hos fisk som under utvecklingen exponeras för EE2 i de låga halter som finns i naturen. Den östrogenreceptor som uttrycks i högst koncentrationer under utveckling, är inte densamma efter exponering till EE2. En uppreglering av erα, som vanligen uttrycks starkt under mognad, sker som svar på exponeringen (Paper III). Exakt vad detta skifte betyder är svårt att säga men i Paper IV ser vi i ett födosöksexperiment att mörtar som blivit exponerade äter sämre och väger mindre. Samma effekt ser vi i större tunnor som simulerar ett riktigt ekosystem, d.v.s. med arter från alger till djurplankton och fisk. De tunnor som blev exponerade hade mer djurplankton kvar (mörtens föda) jämfört med de tunnor som inte hade exponerats för EE2. I en annan fiskart, zebrafisken, vet man sedan tidigare att östrogenreceptorn spelar en avgörande roll för utvecklingen av sidolinjen, fiskens balansorgan. Om det är så att EE2 stör utvecklingen av sidolinjen kan fisk som exponerats helt enkelt ha svårt att orientera sig när den söker efter föda.

På 1990-talet uppmärksammades det att testikelcancer, bakgrundsbruset av främmande ämnen i blodet och tidigarelagd mognad hade ökat. Detta kopplades samman med utsläpp från endokrina störningssubstanser. År 2011 uppmärksammade läkarna EE2 och klassificerade ämnet som EPPP (environmental persistent pharmaceutical pollution) och år 2014 togs naturligt östrogen (E2) och syntetiska EE2 upp på en lista inom EU över ’skadande ämnen’, som bör övervakas för att kunna hålla halterna så låga som möjligt i naturen. Utsläpp från EE2 bär själv inte ansvaret för ovan nämnda mänskliga problem, men är fortfarande ett ämne som bör hållas lågt för de vedertagna konsekvenserna det får i vår vattenmiljö. Tekniska lösningar i reningsverken testas för tillfället, bland annat i Sverige och Danmark, och de verkar vara framgångsrika även om kostnad och eventuella utsläpp med dessa bör beaktas. En kombination av uppströmsarbete, här definierat som kunskapsutbyte mellan utskrivare av preventivmedel och akademin, presenteras som en lösning i Paper V. I min avhandling har jag tagit upp medvetenheten i samhället om effekterna av EE2, det är den första studien som tar upp de sociala värderingarna kring utsläpp av endokrina störningssubstanser i miljön och som öppnar upp för många fler frågor. I Sverige subventionerar vi preventivmedel till unga, men kunskapen kring vad som subventioneras är dålig bland beslutsfattarna och det är till största delen hormonella preparat som ingår i förmånen. Kunskapen om de hormonfria alternativen är dåliga, troligen på grund utav att de behandlas som en skild kategori. Paper V visar också på att information och rekommendationer ges främst om hormonella preventivmedel trots att barnmorskors arbetsuppgift är att sakligt informera om alla tillgängliga preventivmedel. En anledning anges vara det krångliga subventioneringssystemet.

Sammanfattningsvis så understryker mina resultat den komplexa interaktionen mellan östrogen och dess receptorer och att effekter av utsläpp av hormonella preventivmedel beror på vilken vävnad man studerar samt under vilka livsstadier. I den allmänna kunskapen kring hur EE2 påverkar fisk och miljön har vi påvisat sambandet mellan exponering, förändring i födosöksbeteende och genuttryck och på så vis de konsekvenser det kan ha för strukturen och funktionen i ekosystem. Jag har också visat att svenska barnmorskor önskar mer kunskap kring problematiken med hormonella preventivmedel då information kommer främst från läkemedelsföretag. Kombinerat med uppdaterade rekommendationer kring normer och tillämpning för en säker och hälsosam prevention från myndigheter skulle detta kunna bidra till att sänka halterna av EE2 i miljön samt bättre möta de kvinnor som har allt fler frågor kring sin egen hälsa och miljöeffekter. Sammanfattningsvis så bidrar denna avhandling med viktiga delar från olika vinklar kring endokrina störningssubstanser. Kunskapen kring laxfiskars flera östrogenreceptorer och det komplexa interagerande de har kan underlätta förståelsen kring EE2s effekter. Den här avhandlingen öppnar också för ett nytt och underskattat fält i arbetet kring EDC, arbetet med vår uppfattning och användning av hormonella preventivmedel, så kallat uppströmsarbete.

• author: Nikoleris, Lina
• supervisor: Maria Hansson
• opponent: Cresko, William A., The institute of Ecology and Evolution University of Oregon
• organization: Centre for Environmental and Climate Science (CEC); Biodiversity; Environmental Science
• publishing date: 2016
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Other Natural Sciences not elsewhere specified; Biological Sciences
• keywords: the estrogen receptor, salmon evolution and ecology, contraceptives, information gaps, synthetic hormones, EE2, Atlantic salmon (Salmo salar), brown trout (Salmo trutta), roach (Rutilus rutilus)
• pages: 128 pages
• defense location: Blå Hallen, Ecology building, Sölvegatan 37, Lund
• defense date: 2016-03-04 10:00:00
• ISBN: 978-91-7623-631-4
• ISBN: 978-91-7623-630-7
• project: Hur hormonreceptorer uttrycks, evolverar och påverkars av miljöföroreningar i lax- och öringspopulationer
• language: English
• LU publication?: yes
• id: a83e5d91-b763-48e8-b5e6-56e26f07857d (old id 8604360)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:12:52
• date last changed: 2020-05-11 17:30:54