Domain swapping as a molecular mechanism in amyloidosis

Abstract

Amyloidosis is a group of diseases characterized by a change in protein conformation resulting in aggregation and tissue deposition of amyloid fibrils. One variant of cystatin C, L68Q cystatin C, is highly amyloidogenic and persons carrying the corresponding gene suffer from massive cerebral amyloidosis leading to brain hemorrhage and death. Amyloidogenic proteins like cystatin C and prion proteins have been shown to form dimers by exchange of subdomains of the monomeric proteins. This process, called ?domain swapping?, has also been suggested to play a part in the generation of amyloid fibrils. In the present work the role of this mechanism is investigated. Two variants of wild type and L68Q cystatin C, respectively, with disulfide bonds at positions selected to inhibit domain swapping have been produced. It was observed that the capacity of the four proteins to form dimers, oligomers and fibrils was prevented, implying an important role of ?domain swapping? in the aggregation process. Oligomers of cystatin C were detected already in the beginning of the lag phase of the fibrillization reaction. The appearance of these doughnut-shaped oligomers is similar to that described for oligomers of other amyloidogenic proteins. Purified oligomers of cystatin C were shown to fibrillize faster and at a lower concentration than the monomeric protein, suggesting a role of the oligomers as fibril-assembly intermediates. Furthermore, high molecular weight cystatin C immunoreactive components were detected in samples obtained from mice, expressing human L68Q cystatin C, while no such species could be observed in control mice.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Som en blixt från klar himmel drabbas en ung, och till synes frisk person, av hjärnblödning. Denna stroke leder till demens och efterföljande nya blödningar leder slutligen till en för tidig död. Man har kunnat visa att denna sjukdom beror på att en variant av ett visst protein, cystatin C, tvinnar ihop sig till rep-liknande långa fibriller. Dessa fibriller ansamlas sedan i bland annat blodkärlens väggar, vilket leder till att kärlen brister och det blir en blödning.



Det har visat sig att inte bara cystatin C kan bilda fibriller och orsaka sjukdom, utan även andra proteiner kan förändras på liknande sätt. I denna grupp av sjukdomar återfinns bland annat Alzheimers sjukdom och galna ko-sjukan. Detta innebär att det inte bara är patienterna med cystatin C-relaterad hjärnblödning som skulle kunna få hjälp om man kunde lösa orsaken till sjukdomen, utan detta skulle även kunna leda till framsteg inom forskningen av de andra sjukdomarna.



Men, vad är det då som händer? I denna doktorsavhandling beskriver jag mitt arbete med att ta reda på mekanismen som leder till att fibrillerna bildas i kroppen. För att försöka förstå hur fibrillbildningen sker, har vi tittat på strukturen av proteinet. En monomer av cystatin C liknar en hand som sluter sig om sin tumme. I dimeren av proteinet kan man dock se att den ena handen håller om den andra handens tumme, och vice versa. Det vi ser är alltså att en del av proteinet har bytt plats med motsvarande del i en annan molekyl. Denna mekanism brukar kallas ?domain swapping?. I det här fallet har enbart två molekyler bytt delar med varandra, men vad händer om de istället skulle byta delar med ytterligare molekyler? Man skulle kunna tänka sig att vi då kan få en lång kedja som till slut kan bilda en fibrill.



I den här doktorsavhandlingen visar jag att om man ?låser fast? tummen vid sin hand, och därmed stoppar ?domain swapping?, så kan inte dimerer eller fibriller bildas. Därmed verkar ?domain swapping? vara en viktig mekanism för att cystatin C ska kunna aggregera. Detta har vi visat genom att på olika sätt stabilisera monomeren. I framtiden skulle man kanske kunna använda samma metod för att ?låsa fast? den flexibla delen av proteinet med ett läkemedel, vilket skulle kunna användas för att bota patienter.



Jag har även undersökt vad som händer innan en fibrill blir till. Vad finns det för mindre aggregat innan de stora fibrillerna bildas? Det visade sig att cystatin C bildar aggregat som ser ut som ringar långt innan fibrillerna bildas. Dessa ringar har samma utseende som aggregat vilka har hittats vid andra sjukdomar, som till exempel Alzheimers sjukdom. Om man renar upp ringarna kan de bilda fibriller, vilket tyder på att de är byggstenar i fibrillerna. Precis som med dimerer och fibriller hämmas dock bildningen av dessa ringar om ?domain swapping? stoppas, vilket tyder på att denna mekanism är viktig även för bildandet av dessa byggstenar.



Därefter försökte jag att se om dessa ringar kunde hittas hos möss som har samma sjukdom som patienter med cystatin C-relaterad hjärnblödning. Ringar med exakt samma egenskaper som tidigare beskrivits kunde jag inte hitta hos dessa möss. Däremot hittades andra stora aggregat av cystatin C i bland annat blod och hjärna från dessa möss, vilka inte kunde hittas i kontrollmöss. Eventuellt kan även dessa aggregat bildas genom ?domain swapping?, men det får framtiden utvisa.



Denna doktorsavhandling visar alltså på vikten av ?domain swapping? i vissa sjukdomar då fibriller av proteiner ansamlas i kroppen. Genom att känna till denna mekanism får man en möjlighet att i framtiden utveckla läkemedel som specifikt kan hämma ?domain swapping?. Denna strategi skulle kunna utnyttjas i kampen mot ett flertal sjukdomar, såsom till exempel cystatin C-relaterad hjärnblödning och galna ko-sjukan.

• author: Wahlbom, Maria
• supervisor: Anders Grubb
• opponent: Professor Theodorsson, Elvar, IBK/Klinisk kemi, Universitetssjukhuset, 58185 Linköping
• organization: Division of Clinical Chemistry and Pharmacology
• publishing date: 2007
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry; Pharmacology and Toxicology
• keywords: Clinical chemistry, Klinisk kemi, Medicin (människa och djur), Medicine (human and vertebrates), oligomer, dimer, domain swapping, fibril, cystatin C, amyloidosis
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2007:151
• pages: 92 pages
• defense location: Segerfalkssalen, Wallenberg Neurocenter, Sölvegatan 17. Lund
• defense date: 2007-11-24 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-85897-29-2
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Maria Nilsson, Xin Wang, Sylwia Rodziewicz-Motowidlo, Robert Janowski, Veronica Lindström, Patrik Önnerfjord, Gunilla Westermark, Zbigniew Grzonka, Mariusz Jaskolski and Anders Grubb. 2004. Prevention of domain swapping inhibits dimerization and amyloid fibril formation of cystatin C. Use of engineered disulfide bridges, antibodies, and carboxymethylpapain to stabilize the monomeric form of cystatin C. J Biol Chem, vol 279 pp 24236-24245.; Maria Wahlbom, Xin Wang, Veronica Lindström, Eric Carlemalm, Mariusz Jaskolski and Anders Grubb. 2007. Fibrillogenic oligomers of human cystatin C are formed by propagated domain swapping. J Biol Chem, vol 282 pp 18318-18326.; Veronica Lindström, Katarina Håkansson, Anders Grubb and Maria Wahlbom. . Amyloidogenic L68Q cystatin C form high molecular weight species in vivo. (manuscript)
• id: aec11330-4bf2-43c5-bebd-22825dbfb092 (old id 599154)
• date added to LUP: 2016-04-01 15:58:42
• date last changed: 2019-05-22 06:09:57