Combined structural methods to characterize an oligomeric small heat shock protein Hsp21

Abstract

Small heat shock proteins (sHsps) are found in all organisms and evolved early in the history of life, prior to the divergence of the three domains of life (Archaea, Bacteria, and Eukarya). Their malfunction is connected to several different diseases in humans, such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. sHsps are especially abundant in plants, where most are highly upregulated as the first line of defence against heat and other types of stress. sHsps are ATP-independent chaperones that contain a conserved α -crystallin domain with a characteristic β-sandwich fold, flanked by a flexible N-terminal region (NTR), which varies in length between different sHsps and a short C-terminal region (CTR), which contains a conserved I/V-X-I/V-motif important for oligomerization. Since sHsps are highly dynamic, only a few high-resolution structures are available. Most structures have either truncated or unresolved NTR. Hsp21, a dodecameric sHsp found in the chloroplasts of Arabidopsis thaliana and all green plants, has a long NTR with a predicted amphipathic α-helix containing highly conserved methionines. In this thesis, combined structural methods—cryo-electron microscopy, crosslinking mass spectrometry, small angle X-ray scattering, nuclear magnetic resonance spectroscopy, and limited proteolysis—were applied to characterize Hsp21. A structural model for Hsp21 was generated that suggests that oligomerization is maintained by CTR tail-to-tail interactions and that the NTR arms are partly on the outside of the oligomer. The protein-protein interactions between Hsp21 and model substrate proteins were probed by small angle X-ray scattering and crosslinking mass spectrometry showing the NTR in Hsp21 interacts with specific parts of the protected client proteins, presumably the parts that start to unfold under destabilizing conditions. A non-dodecameric mutational variant of Hsp21, Hsp21^V181A, which is mainly dimeric, was found to have decreased chaperone activity and was unable to form client-chaperone complexes to the same extent as the oligomeric Hsp21. This emphasizes that oligomerization is an intrinsic property required for chaperone activity in sHsps. Mass spectrometric quantification was used to explore another possible role of Hsp21, namely interaction with membranes. This study concludes that Hsp21 can translocate into the thylakoid membrane during heat stress, in vivo and in vitro. This thesis points at several new findings concerning the structure and function of Hsp21, a chloroplast-localized chaperone, which is of large importance for adaptation of plants to temperature variations and stress.

Abstract (Swedish)

Undersökning av Hsp21 med korslänknings-masspektrometri
Människans kropp består av ungefär 30 trillioner celler och varje cell innehåller omkring 100 000 proteiner. Föreställ dig om kroppen vore jordklotet, varje vävnad ett land och varje cell en stad. Varje stad vore då konstant som Paris i rusningstrafiken. Trafiken vore helt galen hela tiden och väldigt känslig för även den minsta störning. Cellens proteiner (=bilarna) är extremt viktiga för cellens funktion och de måste vara korrekt veckade för att fungera. Felveckade proteiner kommer att störa hela systemet och bidra till aggregatbildning (=stora bilolyckor), som också är orsaken till många olika sjukdomar som Alzheimers och Huntingons. Därför är det viktigt med en bra infrastruktur och regleringssystem i cellerna, precis som i riktiga städer. Proteinet jag har undersökt i denna avhandling heter Hsp21. Man kan säga att Hsp21 är en av de viktigaste bilmekanikerna i plantornas celler.
Hsp21 är ett protein som tillhör familjen chaperoneproteiner. Namnet chaperoneprotein återspeglar deras syfte: De agerar förkläde till andra proteiner, dvs. ser efter andra proteiner och ser till att de inte deltar i oönskad interaktion och bidrar till problem. Hsp står för ”Heat shock protein” eller värmeshockprotein. Proteinets minsta enhet är 21 kilodalton (Dalton är en standardenhet för att indikera massa på molekylskala) så därför kallas proteinet for Hsp21. Proteinet kommer från plantan Arabidopsis thaliana, eller backtrav och finns i plantans kloroplast. Precis som i plantor så finns det chaperonproteiner i de humana cellerna. Plantor innehåller generellt sett mycket chaperonproteiner eftersom de, olikt de flesta andra levande skapelser, inte kan flytta sig för att undvika stress från starkt ljus och höga temperaturer. Det finns många olika sätt som Hsp21 samt andra chaperonproteiner har blivit undersökta på för se hur de skyddar andra proteiner. Vi kan dela in metoderna i två olika kategorier: in vivo (”i det levande”) och in vitro (”i glas”) metoder. In vivo metoderna används inom själva plantan medan in vitro mätningarna görs i provrör. Jag har mest fokuserat på provrörsmetoder.
Small heat shock proteiner är besvärliga att undersöka eftersom de verkar snabbt och under mycket kort tid. Därför tyckte vi att det vore att föredra att hitta en metod där man kunde ”frysa ögonblicket”.
Detta leder till min huvudmetod: Korslänkningsmasspektrometri. Vi kan säga att korslänkern är en sorts ”lim” som limmar ihop proteiner som kommer nära varandra. Den kan också limma ihop olika delar av ett och samma protein. Först limmar jag ihop proteinerna och sen adderar jag ett enzymet trypsin. Det uppför sig som sax och klipper isär proteinerna i mindre bitar som kallas för peptider. Både trypsinet och korslänkern är väldigt specifika och klipper och limmar bara vid särskilda aminosyror. Detta genererar väldigt speciella peptider som man kan analysera med en masspektrometer. En masspektrometer är ett instrument som kan mäta storleken på peptiderna på ett väldigt noggrant sätt genom att ta tiden på hur lång tid det tar för peptiderna att flyga en viss sträcka. Denna metod är väldig noggrann och känslig. Genom att addera korslänkern och sen analysera vilka peptider har limmats ihop kan vi få information om hur proteiner interagerar och deras struktur ser ut. Det har varit en utmaning att analysera resultaten från masspektrometern eftersom blandingen av peptider i ett prov där proteiner har blivit hopklistrade är väldigt komplex samt att ju bättre instrumenten blir desto fler peptider detekterar de och desto större utmaning blir det att analysera resultaten.
Med denna metod har jag kunnat presentera nya detaljer i Hsp21 strukturen. Jag har också identifierat vilka delar av Hsp21 som interagerar med och skyddar viktiga proteiner som är känsliga för stress. Dessutom har jag mätt hur Hsp21 oväntat dyker in i kloroplastmembranet under värmestress.
Med detta arbete har vi fått ny information om hur Hsp21 fungerar, ett viktigt chaperon i celler på gröna plantor. Under denna process har vi också utvecklat och använt metoder för kemisk korslänknings-dataanalys, som gör det möjligt att snabbt kunna analysera andra chaperoner och proteiner.

• author: Rutsdottir, Gudrun
• supervisor: Cecilia Emanuelsson
• opponent: Prof. Dr. Sinz, Andrea, Institute of Pharmacy, Martin Luther University Halle-Wittenberg, Halle, Germany
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2017-05
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biochemistry and Molecular Biology; Structural Biology
• keywords: Small heat shock proteins, chaperones, crosslinking mass spectrometry, Stable isotope labeling, quantification, small angle X-ray scattering, cryo-electron microscopy, combined structural methods, plant stress
• pages: 200 pages
• defense location: Lecture hall B, Center for chemistry and chemical engineering, Naturvetarvägen 14, Lund.
• defense date: 2017-06-02 09:15:00
• ISBN: 978-91-7422-526-6
• language: English
• LU publication?: yes
• id: b8e3240b-679f-4607-910e-2b46d721ef7c
• date added to LUP: 2017-05-04 12:07:46
• date last changed: 2018-11-21 21:31:46