Plasma Membrane Proteomics and Functional Characterization & Expression Profiling of Plant Aquaporins

Abstract

In order to identify integral and peripheral proteins associated with the plasma membrane (PM), highly purified Arabidopsis PMs were analyzed by mass spectrometry. In total, 238 putative PM proteins were identified, of which 114 were predicted to have transmembrane domains or to be PM-anchored. Identified proteins were involved in transport, signal transduction, membrane trafficking and stress responses. Almost 25% of the proteins were functionally unclassified and more than half of these were predicted to be integral.



In this proteomic study, ten aquaporin (AQP) isoforms were identified. AQPs (also referred to as major intrinsic proteins, MIPs) are integral proteins that facilitate transport of water and other small neutral solutes. In plants, AQPs form a large family with 35 members in Arabidopsis. The number of genes is about the same in moncots. Based on sequence similarity, plant AQPs are divided in four subfamilies: plasma membrane intrinsic proteins (PIPs), tonoplast intrinsic proteins (TIPs), Nod26-like intrinsic proteins (NIPs) and small basic intrinsic proteins (SIPs). By in-house designed cDNA microarrays and quantitative PCR, the expression patterns of all 35 Arabidopsis AQP genes were monitored in leaves, roots and flowers. This showed that many AQP genes were pre-dominantly expressed in either root or flower organs, but none seemed to be leaf-specific. Most PIP and some TIP genes had a high level of expression, while NIP genes were present at a low level. During gradual drought stress of soil-grown plants, PIP transcripts were generally down-regulated in leaves, with the exception of AtPIP1;4 and AtPIP2;5, which were up-regulated. AtPIP2;6 was constitutively expressed. These three PIP genes were therefore further characterized by promoter-beta-glucuronidase (GUS)- and green florescence protein (GFP)-fusions. Also, expression profiling upon drought stress of PIP genes in different Arabidopsis ecotypes was done. No major differences in expression between ecotypes were detected. Instead expression of many PIP genes correlated with plant water content.



Since little is known about the role of AQPs in the elongation zone of growing leaves, an AQP, HvPIP1;6, was cloned from this tissue and characterized by expression in Xenopus oocytes, in-situ PCR and Northern and Western blotting.



The gating of the AQP SoPIP2;1 is caused by phosphorylation at Ser115 and Ser274. Two protein kinases acting on these two sites were purified and characterized. The Ser115 kinase was soluble and Ca2+- independent, whereas the Ser274 kinase was PM-associated and Ca2+-dependent.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Många åtminstone i min generation kommer säkert ihåg att de under gymnasiets biologilektioner fick lära sig att vatten diffunderade fritt över cellens membran ? osmos och fri diffusion var ledorden. Jag vet inte hur läroböckerna är utformade idag, men efter att Nobelpriset i kemi år 2003 tilldelades Peter Agre för upptäckten av att aquaporiner fungerar som vattenkanaler har förhoppningsvis beskrivningen om vattnets väg genom cellmembranerna ändrats och aquaporinerna tillskrivits den viktiga roll de har för vattenbalansen i levande organismer.



För växter liksom för andra levande organismer är vatten livsnödvändigt. Vi vet alla vad som händer när vi glömmer att vattna våra krukväxter. En stor del av mina drygt fyra år som doktorand har jag ägnat åt sådan torkstress av växter, om än under något mer kontrollerade former. Jag har främst studerat modellväxten Arabidopsis thaliana eller backtrav som den heter på svenska. Detta lilla, ettåriga ogräs har blivit växtbiologernas favorit eftersom den är lätt att hantera i ett laboratorium och eftersom hela genomet är kartlagt (Arabidopsis thaliana har ca 26000 gener, alltså ett tusental fler än människans ca 25000!).



Man vet idag att aquaporinerna bildar en hel familj av besläktade proteiner som återfinns i bakterier, djur och växter. Generellt verkar växtarter ha över 30 stycken olika sorters aquaporiner. Vi människor har 13 stycken som har betydelse för alltifrån vattenupptaget i njurarna till salivutsöndringen i munhålan. Många aquaporiner återfinns i det membran som omsluter cellen, plasmamembranet. I Paper I i den här avhandlingen identifierade vi över 200 stycken plasmamembranproteiner med hjälp av mass-spektrometri, en metod som under de senaste tio åren har anpassats och utvecklats till att göra snabba proteinidentifieringar (apropå Nobelpris gav denna metod Fenn, Tanaka och Wütrich Nobelpriset i kemi 2002). Tidigare visste man inte var i cellen majoriteten av dessa identifierade proteiner fanns. Nu vet vi att de finns och verkar i cellens plasmamembran.



Vattentransport kan ske på olika sätt i växten. Över längre distanser såsom från rötterna till bladen sker transporten i det som kallas xylem vilket består av långa rörlika, döda celler. På cellnivå måste däremot vattnet ta sig genom plasmamembranet vilket sker genom aquaporinerna som alltså kan ses som vattenkanaler på molekylär nivå. För att påverka flödet av vatten kan aquaporinerna regleras på olika sätt. Ett sätt är att de öppnas och stängs genom att deras struktur förändras genom fosforylering, en process då en fosfatgrupp binds till proteinet. Detta är något som undersöks i Paper V. Ett annat sätt är att växten ökar eller minskar antalet vattenkanaler genom att ändra aktiviteten hos de gener i genomet som kodar för just aquaporiner. Man säger att generna upp- eller nedregleras. Cellen kan på så sätt styra antalet vattenkanaler och tillgodose sitt vattenbehov. Dessa regleringsmekanismer påverkar inte bara enskilda celler utan även hela växtens vattenbalans. I rötterna tror man t ex att detta molekylära vattenflöde genom aquaporinerna har stor betydelse för upptaget av vatten ur jorden.



För jordbruket är det intressant att hitta grödor som är torktåliga och som inte behöver så mycket vatten. Extrem torka förstör årligen skördar för många miljarder svenska kronor världen över och leder i värsta fall till svält. Idag vet man inte mycket om vad som gör vissa varianter inom samma växtart mer eller mindre torktåliga. Man vet däremot att om man modifierar aquaporinernas genaktivitet, alltså påverkar antalet vattenkanaler, så inverkar detta på växtens torktålighet. Genom att koppla aktivitetsprofilen till graden av torktålighet är vår förhoppning att det i framtiden ska bli möjligt att snabbt identifiera vilka varianter som är torktåliga.



I Paper II och III i den här avhandlingen undersökte vi därför hur torkstress påverkade genaktiviteten av olika aquaporiner i Arabidopsis thaliana. Vi fann att de flesta ned-reglerades under torkstress, vilket kan verka rimligt eftersom växten vill minimera vattenförlusterna vid torka och gör detta genom att minska antalet vattenkanaler. Men två typer av aquaporiner, AtPIP1;4 och AtPIP2;5 ökade istället i antal. Vad detta beror på vet vi inte helt säkert; möjligen återfinns dessa två i sådana celler vars vattenförsörjning är extra viktig för att hela växten ska överleva. För att ytterligare undersöka var i växten AtPIP1;4 och AtPIP2;5 fanns gjorde vi därför konstruktioner med delar av dessa gener tillsammans med särskilda rapportörgener. På så sätt kunde vi genom fluorescens eller infärgning följa i vilka växtvävnader eller i vilka delar av cellen AtPIP1;4 och AtPIP2;5 återfanns. Bilderna från detta finns i Figur 3, 4 och 5 i Paper III.



Genom att mäta genaktiviteten i flera olika varianter av Arabidopsis, så kallade ekotyper, som under evolutionen utvecklats i miljöer med antingen mycket (Edinburgh, Skottland) eller lite (Lipowiec i södra Polen) nederbörd fann vi att uppregleringen av AtPIP1;4 och AtPIP2;5 var generell och oberoende av utvecklingsmiljö. Att undersöka olika ekotyper är ett sätt att använda sig av den naturliga genetiska variation som finns mellan populationer inom samma art.



En viktig del av de studier som bedrivs med Arabidopsis thaliana är att överföra kunskaperna från denna modellväxt till grödor som används inom jordbruket, som ju behöver stora mängder vatten. I Paper IV undersöktes därför en nyupptäckt aquaporin i korn vilket är en ekonomiskt viktig gröda. På många ställen i världen används idag en alldeles för stor del av grundvattnet till konstbevattning. I Indien pumpas t ex två gånger mer av grundvattnet upp än vad som ersätts av regn. Dessutom kommer ett framtida ökat välstånd att ytterligare göra behovet av vatten större. Idag behövs t ex 11000 liter vatten för att producera en enda 120-gramshamburgare. En ökad förståelse av hur växter använder och hushåller med sitt vatten är därför viktig för framtidens jordbruk med tanke på jordens begränsade vattenresurser.

• author: Alexandersson, Erik
• supervisor: Per Kjellbom
• opponent: Professor Maurel, Christophe, Agro-M/INRA/CNRS, Université Montpellier 2
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2006
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Chemical Sciences
• keywords: Växtbiokemi, Plant biochemistry, phosphorylation, barley, GFP, GUS, quantitative real-time reverse transcriptase PCR, microarray, aquaporin, MIP, Arabidopsis, plasma membrane, proteomics
• defense location: Lecture hall A at the Center for Chemistry and Chemical Engineering, Getingevägen 60, Lund
• defense date: 2006-10-28 10:15:00
• ISBN: 91-7422-129-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Center for Chemistry and Chemical Engineering (011001000), Biochemistry and Structural Biology (S) (000006142)
• id: c80bf124-5b45-46f4-81e8-c48b1270cd27 (old id 547294)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:37:03
• date last changed: 2018-11-21 20:59:48