From Time-Averaged to Time-Resolved Crystallography: Studies on Superoxide Dismutase and Myoglobin

Abstract

We have studied protein motions with nanosecond time-resolved crystallography. The release of carbon monoxide from its complex with myoglobin (MbCO) was triggered by nanosecond laser pulses. X-ray data were collected with time delays ranging from 4 ns to 1.9 ms using the Laue method, at the European Synchrotron Radiation Facility in Grenoble. For the first time point, X-ray pulses of 150 ps duration were used. Electron difference maps show the release of the CO and the subsequent motion of the iron out of the haem plane. In the 4 ns difference map, a positive density feature is found at a position coinciding with that of an intermediate docking site seen at low temperature. The following time points show the rebinding of the CO, and also indications of protein relaxations extending further than 4 ns. This is the first time-resolved protein crystallography experiment with nanosecond time-resolution yielding structural results.



We have developed instrumentation and methods for time-resolved protein crystallography, including a method to reduce the noise in electron density difference maps from poorly accurate data. The method is also applicable to other cases where the signal to noise ratio is low.



The crystal structure of iron superoxide dismutase (SOD) from the hyperthermophilic archaeon <i>Sulfolobus solfataricus</i> has been determined to 2.3 Å resolution by molecular replacement. The structure revealed an increased number of inter-subunit ion-pairs in a compact tetramer. We suggest this to be important for the thermostability. However, the general fold is found to be similar to other known iron- or manganese SOD structures. In addition, the electron density maps revealed an unexpected and unusual covalent modification of a conserved tyrosine in the active site.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Ett proteins funktion bestäms av dess tredimensionella struktur. Proteiners stora betydelse för liv, så som vi känner det, och vår önskan att förstå det leder oss därför till att studera proteiners struktur. Målet kan vara att förstå en specifik process i en specifik art, kanske för att hitta ett botemedel mot en sjukdom som beror på ett icke-fungerande protein, eller mer generellt att förstå det fantastiska samspelet mellan de komponenter som tillsammans formar biologiskt liv. Liv är dock inte ett statiskt tillstånd, utan en process i utveckling. Detta är inte bara sant för evolutionär utveckling av en art eller en individs utveckling, utan också det normala tillståndet på den kemiska nivån i en cell. Den roll som ett särskilt protein spelar bestäms av dess dynamiska beteende, eller med andra ord, av de olika tredimensionella strukturer som proteinet antar beroende på dess inneboende egenskaper och på dess omgivning.



Röntgenkristallografi är den mest allmänt använda metoden för att bestämma ett proteins fullständiga tredimensionella struktur. Det var också den metod som för fyrtio år sedan användes för att bestämma den första proteinstrukturmodellen (av myoglobin). Kristallografi ger emellertid en i stort sett statisk bild av proteinstrukturen.



Arbetet i min avhandling har delvis bestått i utveckling av tidsupplöst kristallografi. Idén är att sätta igång en reaktion i proteinet och att studera vad som händer genom att använda mycket korta röntgenpulser för att se hur proteinets struktur utvecklar sig i tiden. I idealfallet får man en film som visar proteinets dynamiska beteende. Flera svårigheter måste dock överkommas, först och främst det faktum att en kristall inte består av en enda proteinmolekyl utan av ungefär en miljon miljard molekyler (en enda molekyl ger en för liten signal för att man skall kunna studera molekylen). I kristallografi ser vi medelvärdet av alla molekyler, d.v.s. vi måste få alla molekyler att utföra samma rörelser för att det inte bara skall bli en suddig bild.



Vi har studerat bindning av kolmonoxid till myoglobin som är ett protein som lagrar syre i muskelvävnad. I vårt experiment börjar vi med kolmonoxiden bunden till myoglobinet. Vi låter en kort laserpuls frigöra kolmonoxiden och sedan belyser vi proteinkristallen med korta röntgenpulser vid vissa bestämda tidpunkter efter laserpulsen, och erhåller på så sätt ett antal stillbilder av processen. Vår första stillbild är tagen fyra miljarddels sekund efter att laserpulsen träffade kristallen.



Våra experiment visar hur kolmonoxiden frigörs samt därefter under en mycket kort tid (kortare än en miljondels sekund) stannar kvar inuti proteinet i en bestämd ficka, för att sedan fortsätta ut i omgivningen. Vi ser också hur proteinet “rekylerar” och anpassar sig till den nya situationen.



Tidsupplöst kristallografi är krävande bland annat vad beträffar röntgenstrålarnas intensitetet. Därför har dessa experiment utförts vid den europeiska synkrotronen i Grenoble, Frankrike, som tillsammans med en anläggning i USA och en i Japan ger det mesta intensiva röntgenljuset för materialforskning. Även Norden har en synkrotron som används för proteinkristallografi och annan materialforskning. Den heter MAX och ligger i Lund. Röntgenljuset är inte lika intensivt men tillåter bestämning av proteiners statiska struktur. Det är det viktiga första steget mot förståelse av ett protein. Kristallografiska experiment där man följer en reaktion när den äger rum i proteinmolekylerna kommer att förbli mer ovanliga experimentt som tillåter en utveckling av förståelsen av de grundläggande mekanismerna i proteiner. Denna förståelse kan sedan, till exempel m.h.a. teoretiska beräkningar, tillämpas på andra proteiner (som man har bestämt den statiska strukturen av).



I min avhandling ingår även studier av den (statiska) strukturen av ett protein som heter superoxid dismutas. Det är ett enzym som är viktigt för att cellen skall bli av med reaktiva ämnen (syreradikaler) som annars riskerar att förstöra cellens byggstenar (och eventuellt ge upphov till någon sjukdom). Vi har studerat enzymet från en arkebakterie som heter <i>Sulfolobus solfataricus</i> och som lever i heta, svavelrika vattensamlingar med lågt pH. Bakterien upptäcktes vid Solfatarakratern norr om Neapel i Italien.



Vi har bland annat studerat vad det är som gör att proteinet, och bakterien, kan fungera vid så höga temperaturer. Det finns stora industriella intressen av att kunna framställa temperaturtåliga enzym. Förståelse av vad det är som gör enzymet temperaturtåligt är ett första steg mot det målet.

• author: Ursby, Thomas
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Hajdu, Janos, Uppsala university
• organization: MAX IV Laboratory
• publishing date: 1998
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: superoxide dismutase, Bayesian statistics, electron difference maps, synchrotron, docking site, photolysis, myoglobin, Time-resolved crystallography, Laue, thermostability, Sulfolobus solfataricus, Molecular biophysics, Molekylär biofysik
• pages: 176 pages
• defense location: Lecture hall C, Chemical Center, Sölvegatan 39, Lund
• defense date: 1998-09-26 10:15:00
• ISBN: 91-628-3116-X
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: Common Features Involved in Protein Hyperthermostability derived from the Crystal Structure of Iron Superoxide Dismutase from the Archaeon Sulfolobus solfataricusUrsby, T., Adinolfi, B.S., Al-Karadaghi, S., De Vendittis, E. & Bocchini, V. (1998)Submitted to Journal of Molecular Biology. Article: New Opportunities for Time Resolved X-ray Scattering at the ESRFWulff, M., Ursby T., Bourgeois, D., Schotte, F., Zontone, F. & Lorenzen, M. (1996)Journal de Chimie Physique et de Physico-Chimie Biologique, 93, 1915-1937. Article: Feasibility and Realization of Single-Pulse Laue Diffraction on Macromolecular Crystals at ESRFBourgeois, D., Ursby, T., Wulff, M., Pradervand, C., LeGrand, A., Schildkamp, W., Labouré, S., Srajer, V., Teng, T.-Y., Roth, M. & Moffat K. (1996).Journal of Synchrotron Radiation, 3, 65-74.Improved Estimation of Structure Factor Difference Amplitudes from Poorly Accurate DataUrsby, T. & Bourgeois, D. (1997)Acta Crystallographica, A53, 564-575. Article: Photolysis of the Carbon Monoxide Complex of Myoglobin: Nanosecond Time-Resolved CrystallographySrajer, V., Teng, T.-Y., Ursby, T., Pradervand, C., Ren Z., Adachi, S., Schildkamp, W., Bourgeois, D., Wulff, M. & Moffat K. (1996)Science, 274, 1726-1729.
• id: cc221e8a-e9d9-4065-b999-56777f3818a3 (old id 38902)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:33:50
• date last changed: 2018-11-21 21:05:40