Catabolism of Pyrimidines in Yeast

Abstract

Pyrimidines are important precursors for nucleic acids, and constantly synthesized and degraded in the cell to maintain a balanced supply. Many microoganisms can also extract the nitrogens from the pyrimidine ring, and use them as a nitrogen source when “preferred” sources are absent. Four different pathways, by which pyrimidines can be degraded, are known. I have studied the last discovered, but second most common one, called the URC pathway. It operates in several yeast and bacteria, and is so far the only complete degradation pathway found among yeast and fungi. The baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae is unable to degrade pyrimidines; however its distant relative, Lachancea kluyveri is able to utilize pyrimidines and their intermediates as a source of nitrogen.

During my PhD project, I have studied the pyrimidine catabolism in L. kluyveri, in order to identify the genes involved, determine their function and how they are regulated. In total, six genes have been identified to take part in the utilization of uracil, and the function of URC8 has been determined. I have also characterized a specific regulatory protein of the pathway, Urc2p, and analyzed the overall regulation of the L. kluyveri genome in response to different sources of nitrogen, thereby finding evidence of nitrogen catabolite repression. In addition, intermediates of the pathway have been determined, and several transporters related to nitrogen metabolism have been investigated. In conclusion, the research presented in this thesis contributes to greater knowledge about the pyrimidine metabolism in yeast, although there are still details to be resolved in the future.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Introduktion till nukleotider

Nukleotider är viktiga byggstenar för DNA och RNA. Det finns två typer av nukleotider, puriner och pyrimidiner. Nukleotider kan även fungera som signalmolekyler inom eller mellan celler. Dessutom kan många encelliga mikroorganismer, så som jäst och bakterier, använda dem som kvävekälla, genom att bryta ner dem och utvinna kvävet, som sedan kan användas för att tillverka andra molekyler. Hos människor har man sedan 50-talet använt olika modifierade nukleotider för att behandla sjukdomar så som cancer och HIV. De modifierade nukleotiderna stör cellens metabolism, vilket kan få den att begå självmord (apoptos),vilket drabbar snabbt växande celler, som cancer-celler, mer är de andra cellerna i kroppen.

Det är mycket viktigt för alla celler att ha ständig, balanserad tillgång på alla nukleotiderna. Därför pågår hela tiden tillverkning och nedbrytning under kontrollerade former, särskilt i växande celler.

Ny-syntes av nukleotider är en av de cellulära processer som uppstod längst tillbaka i tiden. Både syntesvägen för purininer och den för pyrimidiner ser i princip likadan ut i alla olika organismer. Förutom några enstaka parasiter, har alla organismer förmågan att tillverka alla nukleotider de behöver. Detta kräver dock mycket energi, så därför har många lärt sig att återanvända och omvandla färdiga nukleotider, för att spara på sina resurser. Större organismer, som människor och djur, tar upp dem från maten, medan mikroorganismer har speciella transport-proteiner som tar upp nukleotider från deras omgivning. Inne i cellen behövs bara några mindre modifieringar, som inte alls kräver lika mycket energi.

Till skillnad från ny-syntes, är det inte alla organismer som har förmågan att bryta ner pyrimidiner. Dessutom känner man idag till fyra olika nedbrytningsvägar som det kan ske med. De allra vanligaste kallas den reduktiva nedbrytningsvägen, och finns hos växter, djur, insekter och några bakterier. Delar av den finns även hos flera jäst-arter, men jäst saknar enzymet (proteinet) som utför det första steget. I vår labb-grupp har vi hittat en annan nedbrytningsväg, som kallas URC och finns hos flera olika jäst- och bakterie- arter.



Vad har jag forskat om, egentligen? – en summering av viktiga resultat

Vi upptäckte URC-nedbrytningsvägen genom att studera pyrimidin-nedbrytning i jästen Lachancea kluyveri. Den är en avlägsen släkting till den vanligaste jästen (Saccharomyces cerevisiae), som är den jäst som används i bröd, vin och öl. Men eftersom vår modelljäst kan bryta ner pyrimidiner, vilket inte den vanliga jästen kan, använde vi den istället. Vi skapade mutationer i olika gener, och tog reda på vilka som behövdes för att jästen skulle kunna bryta ner uracil (artikel I). Generna döptes till URC1-6. För några av dem kunde vi räkna ut funktionen, eftersom funktionen hos homologer i andra organismer var känd (homolog= annan gen med samma ursprung som oftast har samma funktion). Två gener, URC1 och URC4, är okända, och vi har därför försökt att ta reda på deras funktion och struktur. Även om vi har hypoteser om vad de gör för något, har det visat sig svårt att bevisa om vi har rätt, så vi har ännu inte lyckats få några pålitliga resultat för dessa gener.

En annan gen, URC2, kodar för en transkriptionsfaktor. I mitt arbete har jag visat att den aktiverar de andra generna i URC nedbrytningsvägen när det finns uracil tillgängligt, samt identifierat vilken DNA sekvens den binder till (artikel V).

Jag har även, tillsammans med flera kollegor, studerat hur uttrycket av alla generna i min modelljäst (L. kluyveri) påverkas när jästen odlas med olika kvävekällor som näring (artikel IV). Genom dessa studier har vi visat att de gener som behövs för att utvinna kvävet ur olika pyrimidiner stängs av när det finns en bättre kvävekälla tillgänglig (fenomenet kallas ”nitrogen catabolite repression”). Det är ett sätt för jästen att spara energi. Vi kunde även identifiera flera potentiella nya gener som kan vara inblandade i nedbrytningen av pyrimidiner. En av dem, kallad URC8, lyckades vi bestämma funktionen på, och visade att den hjälper till att bryta ner en giftig biprodukt som bildas i URC-nedbrytningsvägen. När vi tog bort genen, kunde jästen fortfarande bryta ner pyrimidiner, men den blev ”sjuk” och växte mycket långsamt. Dessutom tog vi reda på att det transport-protein som kodas av FUI1-genen hjälper till att ta in uridin i cellen (uridin = uracil med en sockermolekyl på). Allt detta finns i artikel IV.

Artikel II och III är mindre artiklar. I den ena uppskattade vi vilken molekyl URC4 bryter ner, och i den andra presentar jag en plasmid som jag har konstruerat till min favorit-jäst. En plasmid är en liten cirkulär DNA-molekyl, som är gjord för att kunna föras in i en eller flera celltyper. I plasmider kan man sätta in en bit DNA, t.ex. en gen, så att cellen får en ny egenskap när man för in plasmiden. Den jag designade gör att genen man sätter in blir starkare uttryckt är normalt, så att man får mycket protein, och sätter på en kort extra sekvens som underlättar upprening av proteinet.



Kan man använda det till något?

Min forskning är så kallad grundforskning, och kan inte direkt användas i medicinskt eller industriellt syfte. Men sådan forskning är ju också viktig, eftersom forskning om t.ex. läkemedel bygger på grundforskning. Även inom grundforskning utnyttjar man grundkunskaper som andra kommit fram till och publicerat i vetenskapliga tidskrifter. När det gäller min forskning så är det möjligt att kunskapen om de olika enzymen som är inblandade skulle kunna utnyttjas inom industrin för att framställa modifierade nukleotider. Man kan också tänka sig att nya antibiotika skulle kunna utvecklas för att specifikt hindra funktionen av någon av de gener som inte finns hos människor, som URC1 eller URC4. Eftersom fler och fler sjukdomsframkallande bakterier blir resistenta mot de antibiotika som finns idag, försöker man hela tiden hitta nya.

• author: Rasmussen, Anna
• supervisor: Jure Piškur
• opponent: professor Schacherer, Joseph, Strasbourg
• organization: Molecular Cell Biology
• publishing date: 2014
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Pyrimidine degradation, catabolism of pyrimidines, nucleic acid precursors, yeast, Lachancea kluyveri, URC pathway
• categories: Higher Education
• pages: 136 pages
• defense location: Lecture Hall, Biology Building A
• defense date: 2014-01-24 09:30:00
• ISBN: 978-91-7473-801-8
• language: English
• LU publication?: yes
• id: d6de291f-19fc-413c-9bdb-cfd9bebab844 (old id 4196228)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:11:12
• date last changed: 2018-11-21 20:57:18