Battling Bacterial Biofilm - antibiotic regimens targeting Grampositive pathogens in biofilm

Abstract

AbstractBacteria in most environments encase themselves in a hydrated matrix of polysaccharide and protein, forming organized communities called biofilms. In the biofilm bacteria are protected against hostile environments. Biofilms are important clinically because of their persistence despite host defence and their recalcitrance to antimicrobials.

This thesis presents three main findings: (i) biofilm formation is an important virulence trait for opportunistic pathogens; (ii) combining different antibiotics may successfully cure device-related infections with biofilm-producing bacteria; (iii) mature biofilm is highly resistant to antibiotics.

First, we observed that the opportunistic pathogen Propionibacterium acnes, when isolated from deep infections, produced more biofilm in a microtitre model of biofilm formation, than superficical P.acnes isolates. The serotype distribution of P.acnes, determined by sequencing of recA, was similar among isolates from skin and deep infections, demonstrating that P.acnes isolates with different genetic backgrounds have pathogenic potential.

Furthermore, we observed that Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium biofilms in vitro were susceptible to antibiotic combinations including rifampicin. Resistance to rifampicin was detected early if this agent was used as monotherapy, whereas combining it with some other specific antibiotics counteracted the development of rifampicin resistance.

Finally, we demonstrated that mature biofilm of enterococci in vitro is much more tolerant to antibiotics compared to new biofilm of the same species.

In conclusion, this thesis provides in vitro data stressing the importance of understanding the properties of bacterial biofilm in order to achieve successful antibiotic treatment of device related infections.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vår hud och våra slemhinnor är ständigt koloniserade med bakterier som lever i fredligt samspel med vår organism. Dessa bakterier tillhör vår normalflora och kan indelas i kommensaler respektive opportunistiska bakterier. Kommensalerna gagnar värden på olika sätt och orsakar inte sjukdom, till skillnad från opportunisterna som under vissa betingelser kan orsaka infektion. Ibland rubbas samspelet av olika faktorer som påverkar värden, såsom vid skador, eller annan sjukdom. De opportunistiska bakterierna kan då, i samband med att immunförsvaret sviktar, ta sig till annars bakteriefria platser i kroppen.

De opportunistiska bakterierna kan bilda biofilm på främmande material i kroppen och blir därigenom svåråtkomliga för immunförsvaret. I biofilmen är bakterierna i ett speciellt metabolt tillstånd och inbäddade i ett skyddande matrix. Eftersom antibiotika har svårt att avdöda bakterier i biofilm så krävs ofta mycket långa behandlingstider och ovanliga antibiotikakombinationer. Ofta är dock antibiotikabehandling otillräcklig varför kirurgiskt avlägsnande av det främmande materialet fodras vilket får stora konsekvenser för patienten om infektionen har drabbat t ex en led- eller hjärtklaff protes. Biofilmsassocierade infektioner har blivit vanligare eftersom främmande material i form av katetrar, elektroder och proteser introduceras i kroppen i allt större utsträckning. Vidare lever fler patienter med nedsatt försvarsförmåga allt längre, vilket gör att opportunistiska bakterier oftare kommer att orsaka sjukdom.

Bakteriers ökade motståndskraft mot antibiotika har rönt stor uppmärksamhet de senaste åren och resistenta bakterier utgör ett enormt kliniskt problem i många länder. Få nya antibiotika är under utveckling och även i Sverige ökar resistensen på ett oroväckande sätt bland stafylokocker, enterokocker och andra tarmbakterier. De resistenta bakterierna finns framförallt på sjukhus i de miljöer där de mest infektionskänsliga patienterna vistas. Dessa patienter har dessutom ofta främmande material i kroppen och det är i stor utsträckning här som de opportunistiska bakterierna orsakar biofilmsrelaterade infektioner. Biofilmsbildande opportunistiska bakterier såsom enterokocker är generellt motståndskraftiga mot antibiotika och eftersom bakterierna i biofilm är än mer motståndskraftiga så skulle nya strategier för diagnostik och behandling vara av mycket stort värde.

Den här avhandlingen innehåller fyra arbeten om de opportunistiska bakterierna Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis och Enterococcus faecium, vilka alla kan bilda biofilm, har mer eller mindre besvärliga antibiotika resistensmönster och kan orsaka främmande kroppsinfektioner i t ex ledproteser.

Arbete 1 Protesinfektioner är ibland komplicerade att diagnosticera, delvis på grund av otillräckliga mikrobiologiska metoder som gör det svårt att säkerställa bakterie förekomst. På 90-talet gjordes en studie 192 där mer specifik diagnostik användes och denna visade att en stor del av protesinfektionerna med oklar bakteriegenes var orsakade av P.acnes. Detta var förvånande då P.acnes länge hade betraktats som en relativt harmlös hudbakterie. Studien inspirerade till arbete 1 som visar att P.acnes från djupa ledprotesinfektioner bildar betydligt mer biofilm än P.acnes bakterier från friska personers hud. Biofilmsbildning verkar alltså vara avgörande för P.acnes sjukdomsframkallande förmåga. Vi bestämde även de olika bakterieisolatens serotyper och undersökte om serotyp och biofilmsbildande förmåga gick att korrelera, samt om en viss serotyp oftare återfanns på huden eller i den djupa infektionen. Vi kunde inte påvisa ett samband, utan återfann olika serotyper i alla grupper. Då vi exponerade P.acnes för blodplasma minskade biofilmsbildningen, vilket stämmer med att P.acnes företrädelsevis ger upphov till främmande kroppsinfektioner på mindre blod genomströmmade lokaler såsom i neurokirurgiska shuntar, ortopediska proteser och i bröstimplantat.

Arbete II behandlar enterococcer som likt P.acnes är en grupp bakterier som tidigare betraktats som harmlösa men som under de senaste tre decennierna har avancerat till en tredje plats bland de mest förekommande sjukhusbakteriena i USA. Enterococcus faecalis och framförallt Enterococcus faecium uppvisar bådar uttalad antbiotikaresistens, stabil biofilmsproduktion, och benägenhet att både förvärva samt dela med sig av nya resistensmekanismer. Tack vare sin biofilmsbildande förmåga blir enterococcer än mer toleranta mot antibiotika. Då få nya antibiotika finns att tillgå var möjligheten att kombinera olika antibiotika som har olika verkningsmekanismer tilltalande. Antibiotika toleransen i en biofilm kan vara 1000 gånger högre jämfört med den i fritt flytande bakterier vilket innebär att det krävs högre antibiotika doser och längre behandlingstider vid biofilmsrelaterade infektioner. Vi visade att E.faecalis producerar robust biofilm som var känslig för kombinationsbehandling med ciprofloxacin och rifampicin eller med linezolid och rifampicin.

I Arbete III visades att behandling med de nya antibiotikatyperna tigecycline, daptomycin och linezolid i kombination med rifampicin hade effekt på E. faecium i biofilm. I både arbete II och III påvisade vi att uttalad rifampicin resistens utvecklas snabbt (inom 72timmar) om rifampicin används som enda preparat vid behandling av biofilm som bildats av enterococcer.

Sammanfattningsvis visar studierna II och III på olika antibiotikakombinationer som har effekt i E.faecalis och E.faecium biofilm in vitro. Det är viktigt att påpeka att resultat från in vitro studier utförda i ”provrör” inte direkt kan appliceras på behandlingssituationer in vivo d v s studier gjorda på djur eller människor men det kan ge en fingervisning om vilka preparat som kan ha potential för vidare utvärdering i främmande kropps relaterade infektioner.

I Arbete IV undersöktes om skillnad i antibiotika känslighet i ny (24timmars) jämfört med gammal (120 timmars) biofilm kunde påvisas. I arbete II och III hade vi demonstrerat effekt av ciprofloxacin, linezolid, daptomycin, och tigecycline i kombination med rifampicin i ny enterococcus biofilm, varför vi använde samma preparat men utsatte den äldrer biofilmen för antibiotika under 24 timmar istället för 8 timmar. Åldrad biofilm visade sig vara mycket motståndskraftig mot alla antibiotika oavsett kombinationer och exponeringstid. Sammanfattningsvis är en åldrad enterococcus biofilm höggradigt resistent mot antibiotika. I den kliniska situationen torde därför tiden från infektionsstart till diagnos och behandling vara av stor betydelse.

• author: Holmberg, Anna
• supervisor: Magnus Rasmussen; Bertil Christensson
• opponent: Professor Svensäter, Gunnel
• organization: Section III
• publishing date: 2013
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Infectious Medicine
• keywords: Biofilm, antibiotic susceptibility, prosthetic joint infection, MBEC, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Propionibacterium acnes.
• pages: 134 pages
• defense location: Belfrage Hall BMC 15
• defense date: 2013-09-20 09:15:00
• language: English
• LU publication?: yes
• id: d6ec1ba7-e7c6-4799-883f-0c7a7f194bd2 (old id 4075405)
• date added to LUP: 2016-04-01 13:13:00
• date last changed: 2018-11-21 20:13:44