The collagen fibrillar network: Sequential degradation of its constituents by tissue metalloproteinases.

Abstract

The cartilage matrix is made up of a fibrillar meshwork comprising type II collagen and other associated proteins. One main function of this network is to retain the large aggregating proteoglycan, aggrecan, a vital component in the regulation of fluid flux in cartilage. In disease such as osteoarthritis, the breakdown of the collagen network appears to be the final step in destruction of cartilage. The aim of the work described in this thesis was to develop specific tools for the detection of extracellular matrix degradation products as a means to monitor cartilage disease. In the first instance we elaborated an ELISA assay specific for denatured type II collagen. Application of this assay to the detection of collagen denaturation in osteoarthritic versus normal cartilage showed that nearly four times greater percentage unwound collagen could be detected in diseased tissue (denatured/total). The focus was then placed on the fate of some of the fibril associated proteins. Indeed we demonstrated that fibromodulin, a member of the leucine rich repeat proteins, was degraded prior to significant loss of type II collagen in a degradative cartilage explant culture system. Only one major product of degraded fibromodulin could be isolated and this was characterised in order to determine its neo N-terminus. This revealed that this product was lacking the entire tyrosine sulphate rich N-terminus and had an intact C-terminus. Cleavage at the same site could also be performed in vitro with purified MMP-13 (not with MMPs 2, 8 or 9). An antibody directed to the neo-N-terminus of this fragment reacted specifically with degraded fibromodulin in Western blotting, but showed poor reactivity with the natural cleavage product in ELISA assay. Prior to further attempts at raising functional antibodies to the cleavage product we opted to characterise the domains surrounding the site of processing. This work showed that the N-terminal cystine double loop has a cruciform structure. This may cause shielding of the epitope by steric hindrance. We also determined experimentally the presence of sulphation on nearly all of the tyrosine residues found in the N-terminus of fibromodulin including those neighbouring the cleavage site. An error in the sequence was also noted and corrected. The information gained from these characterisation studies will be vital in the choice and composition of immunising peptides used to generate neo-epitope antibodies.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Brosk bekläder våra leder och förser dem med en slät yta vilket förhindrar en direkt ben mot ben kontakt. Det fungerar också som stötdämpare i belastade leder och ger glidytan mycket låg friktion. Vatten hålls kvar i broskets matrix på grund av den negativt laddade proteogykanen Aggrecan vilken i sin tur hålls kvar i ett nätverk av kollagenfibrer. När en led belastas pressas vätska ut och när belastningen försvinner sväller det igen på grund av Aggrecans förmåga att attrahera vatten. Kollagenfibrerena är uppbyggda av en mängd enskilda molekyler. I brosk består det huvudsakligen av kollagen typ II, en trippel-helix molekyl som interagerar och bildar fibrer. Kollagen typ IX bekläder fibrerna till vilka de är kovalent bundna. Decorin och Fibromodulin tillhör en annan proteinfamilj, de så kallade ”small leucine rich repeat proteins” och binder även de till kollagen typ II. De är kända för att vara viktiga för en korrekt fiber formering och finns kvar i matrix med en hittills okänd funktion. En möjlig funktion är att de binder till och skyddar fibrerna från proteolytiska enzym såsom matrix metalloproteinaser. Denna familj av proteinnedbrytande enzym är ingående studerad och dess aktivitet är knuten till brosknedbrytning både in vitro och in vivo. I friskt brosk, degraderas uttröttade molekyler av proteolytiska enzym producerade av broskcellerna och förnyas genom nysyntes från samma celler. Denna process är i balans vilket medför att mängden brosk inte förändras signifikant. Vid ledsjukdom är den metabola balansen störd. Den enzymatiska nedbrytning är större än nybildningen av matrixmolekyler. Om denna process fortgår förloras alltmer broskvävnad. Resultatet blir att ett funktionellt matrix inte kan upprätthållas och att broskets stötdämpande funktion försämras. Degradation av matrix verkar uppstå som en sekvens av händelser där förlust av en sorts byggsten (molekyl) sker före förlust en av en annan. Leddestruktion börjar med nedbrytning av Aggrecan och fortsätter med nedbrytning av Kollagen typ II, vilket dock sker sent i förloppet. Förlusten av Aggrecan som ses vid reaktiv artrit är reversibel utan bestående konsekvenser för vävnaden och patienten. Skador som påverkar kollagennätverket ses däremot som bestående och möjlighet till reparation liten. Nedbrytning av broskmatrix är så komplex att förändring av en enskild markör inte räcker för att fastställa sjukdomsstatus hos en patient. Däremot kommer i framtiden en panel av markörer att möjliggöra detta. Arbetet som presenteras i denna avhandling har som mål att öka förståelsen av händelseförloppet av brosknedbrytning i sjukdommar som reumatoid artrit och artros. Vi har arbetat med att utveckla detektion av broskmatrix specifika degradationsprodukter. Utvecklandet av två sådana markörer beskrivs, en är en markör av ett sent skede i sjukdomsförloppet (Kollagen typ II), medan den andra (Fibromodulin) tros representera ett tidigare skede. Proteolys av Kollagen typ II börjar med en definierad klyvning i trippelhelixen genom Kollagenaser (MMP-1, 3, 8, 13 and 14). Den kluvna molekylen vecklas därefter upp och degraderas ytterligare. Markören för degraderat kollagen typ II som utvecklades i detta arbete detekterar enbart kollagen som är klyvt och som inte längre föreligger som trippelhelix. Ökad mängd av fragmentet detekterades i brosk från artrospatienter i jämförelse med brosk från patienter utan artros. Arbetet med markören av tidig broskdegradation (Fibromodulin) har utvecklats till följande nivå: nedbrytningspodukten av Fibromodulin har identifierats vid odling av broskexplantat under degenerativa förhållande. Degradation av Fibromodulin i lösning med framrenade enzym visar att samma klyvningsprodukt bildas av matrix metalloproteinase 13. Klyvningsprodukten av humant fibromodulin var densamma under dessa förhållande. En antikropp framställdes som specifikt reagerar med degradationsprodukten. Den visade sig dock inte fungera optimalt i en kvantitativ assay. Därför undersökte vi den N-terminala delen av Fibromodulin för att fastställa strukturen och eventuell posttransationell modifiering. Både veckning (struktur) och posttransationell modifiering skulle kunna förklara varför anitkroppen inte var tillräcligt kraftfull för kvantifiering. Den första del vi karakteriserade var den N-terminala cysteinloopen. Cystein bindning inom en molekyl är nödvändig för proteiners konformation. Vi fann att de fyra cysteinerna i den N-terminala delen var formerades som en korsad dubbelloop. Det kan spekuleras att den epitop som vi är intesserade av är gömd mellan de två lopperna med följden att steriskt hindra antikroppsinbindningen. Tyrosinsulfatering är en modifikation som uppträder på en del utsöndrade protein där det finns anhopningar sura aminosyror. Fibromodulin har denna typ av modifiering i sin N-terminala del. De exakta positionerna är inte kända. Vi har kartlagt deras possition med masspektrometri. Tyrosinerna i den epitop vi är intresserade av visade sig vara sulfaterade. Antikroppen som vi tillverkade var gjord mot en osulfaterad peptid vilket kan förklara varför den inte fungerade i ELISA-assay. En ökad möjlighet till kvantifiering av degradationsprodukter kan förbättra möjligheten för en tidig diagnos av ledsjukdommar. Vårt arbete beskriver utvecklandet av två potentiella markörer för proteolytisk nedbryning av broskets matrixmolekyler. Vi har också funnit att matrix metallaoproteinas 13 klyver fibromodulin på samma ställe som vi fann vid odling av broskexplantat. Detta är samma proteas som troligen degraderar kollagen i de sena skedet av ledsjukdom. Ökad kunskap om vilka proteaser som klyver matrixmolekyler vid ledsjukdom kan leda till utveckling av specifika hämmare av desamma.

• author: Heathfield, Terrence
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Vuorio, Eero
• organization: Joint and Soft Tissue Unit (research group)
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Orthopedics
• keywords: metabolism, Metabolism, Biochemistry, collagen, fibromodulin, cartilage, osteoarthritis, Biokemi
• pages: 172 pages
• defense location: Ortopediska klinikens förläsningssal, Ing 25, plan 5
• defense date: 2003-10-10 10:15:00
• ISBN: 91-89625-24-2
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: Increased damage to type II collagen in osteoarthritic articular cartilage detected by a new immunoassay.Anthony P. Hollander, Terrence F. Heathfield, Carolyn Webber, Yukiko Iwata, Robert Bourne, Cecil Rorabeck and A Robin PooleJ Clin Invest 93: 1722-1732, 1994Performed at the Joint Diseases Laboratory, Department of Surgical Research, McGill University, Montréal, Québec, Canada. Article: II. Cleavage of Fibromodulin in Cartilage Explants Involves Removal of the N-terminal Tyrosine Sulphate Rich Region by Proteolysis at a Site Which is Very Sensitive to MMP-13.Terrence F. Heathfield, Patrik Önnerfjord, Leif Dahlberg and Dick HeinegårdSubmitted Article: III. Cystine bridging in the N-terminus of fibromodulin follows a Cys76-Cys82 and Cys80-Cys92 pattern.Terrence F. Heathfield, Leif Dahlberg, Dick Heinegård and Patrik ÖnnerfjordSubmitted Article: IV. Identification of Tyrosine Sulfation in Extracellular Leucine-rich-repeat Proteins Using Mass Spectrometry.Patrik Önnerfjord, Terrence F. Heathfield and Dick HeinegårdJ Biol Chem, Accepted
• id: d9648024-34c1-4718-8269-edf3c2854bab (old id 466148)
• date added to LUP: 2016-04-04 13:53:02
• date last changed: 2018-11-21 21:16:56