Nucleic Acids as Drug Targets -Interactions of Platinum Complexes, Polyamines, and siRNA with DNA and RNA Models

Abstract

Drugs targeting nucleic acids were studied in DNA and RNA model systems. The effects were investigated with respect to structural and thermodynamic influence, kinetics, and biological function. The drugs employed in this thesis were anticancer active platinum(II) complexes, polyamine derivatives, and siRNA. Structural changes were determined by use of chemical probing and circular dichroism (CD), thermodynamic properties were determined by use of UV-vis spectroscopy, kinetics determined by use of HPLC and chemical probing, and biological activity was measured with respect to suppression of protein production in Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL) and in in vitro cell cultures.



Formation of covalent adducts between Pt(II) and DNA are believed to be responsible for the anticancer activity of cisplatin. In the present work, the kinetics for the adduct formation reaction was studied as a function of salt concentration with three different platinum complexes as metallation reagents. It was found that with hairpin structures as targets, DNA and RNA are metallated with similar rates. Typically, the platinum(II) complexes formed covalent adducts with the most accessible guanine located in the hairpin loop region. Platination caused the DNA hairpin to change conformation from the natural B-DNA and adopt a Z-like conformation.



Further, platination of both DNA- and RNA oligonucleotides were found to destabilize hairpin and duplex structures. Typically, platination of the middle position of a 13-21 nucleotide long duplex resulted in ca 10 °C decrease of the melting temperature (tm) while platination at the end position only decreased tm by 2-3 °C. Addition of naturally occurring polyamines gave rise to an increase of the tm by ca 10 °C. In contrast, polyamines with substituents on the central nitrogen decreased tm significantly.



Finally, the efficacy of four different siRNAs targeting the AU-rich region in the 3' UTR of Wnt-5a, was studied. Significant down regulation of protein production was obtained with addition of siRNA in the ?M- and nM range, for RRL and cell cultures respectively. Similar trends were observed with respect to protein suppression levels when monitored in RRL and in cell culture systems. Platination of the siRNA sense strands was found to be compatible with significant activity and combined with reduction of off-target effects.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Denna avhandling behandlar modellsystem för farmaka som har DNA och RNA som mål i cellen. Framförallt behandlar den hur strukturen hos DNA och RNA påverkas av inbindning av olika substanser, samt hur fort denna inbindning sker. Tre olika typer av farmaka behandlas:



1. Platinaföreningar som länge använts som cytostatika,



2. RNA interferens som främst har utvecklats under de senaste åren, samt



3. Polyaminer som sedan länge har blivit förknippade med utveckling av cancer och där det finns preparat i klinisk prövning.



6.1 Grundläggande Egenskaper hos DNA och RNA.



DNA och RNA är väldigt lika molekyler men har ändå olika funktion i cellerna. Båda två är uppbyggda av långa kedjor med negativt laddade fosfatgrupper. Mellan varje fosfatgrupp sitter ett socker, deoxyribos för DNA och ribos för RNA. Det är här man återfinner det som gör RNA och DNA fundamentalt olika. I deoxyribos sitter ett väte (i position C'2) medan det i ribos sitter en hydroxylgrupp på samma position. Hydroxylgruppen kan med hjälp av en katalysator, t ex en proton, en fri hydroxylgrupp, eller en metalljon, hydrolysera bindningarna i ryggradskedjan. Vätet i deoxyribosen är emellertid inert. Detta gör DNA till en väldigt stabil molekyl som ansvarar för den långsiktiga lagringen av information i cellerna. DNA är stabilt i tiotusentals år. RNA å andra sidan bryts ner väldigt lätt och är därför lämplig som kortlivad arbetskopia. Bundet till sockret sitter en av fyra olika kvävebaser, guanin (G), cytosin (C), adenin (A) och tymin (T) i DNA. I RNA är tymin (T) ersatt av uracil (U). Detta är den genetiska koden i vilken information sparas i cellerna och så småningom överförs till proteiner.



DNA förekommer i cellerna oftast som en dubbelspiral innehållande två strängar av nukleotider sammanhållna av vätebindningar mellan baserna. RNA förekommer ofta som enkelsträngade molekyler som böjer sig tillbaka och basparar med sig själv, en så kallad hårnål. RNA kan också bilda mer komplicerade strukturer med många hårnåls- eller kors formationer.



Om man tittar på dubbelspiraler av DNA och RNA i ett lite större perspektiv kan man se några ytterligare skillnader. DNA spiralen bildas i så kallad B-form, medan RNA spiralen bildar en så kallad A-form. Skillnaden mellan dessa två ligger i hur vriden eller sammanpackad spiralen är. Båda dubbelspiralerna vrider sig åt höger, men DNA hinner bara med 10 baspar på ett varv, medan RNA spiralen hinner med 11. Det gör DNA-spiralen lite längre och smalare jämfört med motsvarande RNA-spiral. Detta påverkar även laddningstätheten. Fosfat-kedjan, som utgör ryggraden i dubbelspiralerna är negativt laddad, och laddingarna i DNA kommer i och med den utsträckta konformationen längre ifrån varandra, medan laddningarna i RNA dubbelspiralen ligger närmare varandra. Under vissa omständigheter kan DNA också bilda en dubbelspiral som är vriden åt vänster, Z-form. Denna blir, jämfört med B-DNA, ytterligare längre och smalare.



Platinapreparat



I slutet av 1960-talet upptäckte Barnett Rosenberg att en förening bestående av en platinaatom, omgiven av ammoniak (NH3) och kloridjoner (Cl-) hade en hämmande effekt på tillväxten av maligna cancerceller. Det första upptäckta och mest använda platinapreparatet är cisplatin (cis-[PtCl2(NH3)2]) äen känt under namnet platinol. När platina preparaten kommer in i cellerna byts en eller båda kloridliganderna ut mot vatten. Platinakomplexen blir därmed positivt laddade. Tidigare undersökningar visar att det är interaktioner mellan platinakomplexen och DNA som står för aktiviteten hos platinabaserad cytostatika. Platinakomplexen binder till DNA framförallt genom att korsbinda två GG-baser. Detta får DNA molekylen att ändra struktur och böja sig. Friska celler har reparationsenzymer som reparerar en inbindning av platina, men i cancercellerna fungerar det inte riktigt, celldelningen hindras och cellen går i stället in i apoptos, självdöd.



Ett av syftena med avhandlingen var att studera om olika strukturer av DNA och RNA hade betydelse för inbindning av platinakomplex, samt att se hur strukturerna påverkades efter inbindningen. För att undersöka detta användes främst små DNA och RNA hårnålar med fem potentiella inbindningsställen. Runt de negativt laddade nukleinsyrorna bildas ett lager med högre koncentration av katjoner jämfört med koncentrationen ute i lösningen, ett kondensationslager. De positivt laddade platinakomplexen dras mot de negativt laddade nukleinsyrorna och går in i kondensationslagret, där de hittar sitt inbindningsställe. Det visade sig för både DNA och RNA att platinaföreningarna företrädelsevis band till ett inbindningsställe i hårnåls loopen, det mest tillgängliga området. Det visade sig också att hastigheten för inbindningen av platinakomplexen till RNA och DNA var beroende av salthalten i mediet, vilket förklaras av att en högre salthalt skärmar av de elektrostatiska interaktioner som annars drar de positivt laddade platinakomplexen mot de negativt laddade nukleinsyrorna. Reaktionen mellan RNA hårpinnen och platinakomplexen var snabbaren än den för DNA hårpinnen. En möjlig förklaring till detta kan vara den tidigare diskuterade strukturskillnaden mellan RNA och DNA. RNA är mer sammanpressad och har därför en högre laddningstäthet som kan attrahera fler platinakomplex. Med en högre koncentration platinakomplex i närheten av hårpinnen ökar reaktionshastigheten. Inbindnignen av platina gjorde att stabiliteten för hårpinnarna sjönk och DNA hårpinnen fick en struktur som verkar vara vänstervriden, Z-DNA.



RNA Interferens, RNAi



Av det RNA som transkriberas i cellkärnan är det inte allt som kodar för något protein. En del RNA sekvenser omvandlas istället till dubbelsträngat RNA, microRNA (miRNA). Dessa är ungefär 20 baspar långa. Den ena RNA kedjan tas upp av ett proteinkomplex, RISC, och fungerar sedan som guide för att hitta ett komplementärt inbindningsställe på ett mRNA. RISC-miRNA komplexet binder till mRNA och hindrar protein-translationen. Det är även möjligt att föra in korta dubbelsträngade RNA sekvenser i cellen. De kallas då siRNA (small interfering RNA) och processas på samma sätt som miRNA. siRNA är en potentiell läkemedelskandidat för reglering av protein-nivåer i kroppen. Även om det är ett forskningsområde som utvecklats främst under 2000-talet, så finns det redan potentiella läkemedelskandidater av siRNA-typ. Problemet som kvarstår är att leverera siRNA till cellen in vivo.



I det här avhandlingsarbetet designades olika siRNA som hade sin målsekvens i den 3' otranslaterade mRNA regionen. Denna region ligger efter den kodande sekvensen i mRNA och som ofta innehåller inbindningsställen för miRNA och andra molekyler som reglarar proteinuttrycket. Målsekvenserna innehöll också potentiella inbindningsställen för proteiner som stabiliserar mRNA strukturen. Det visade sig först att alla de valda siRNA sekvenserna nedreglerade proteinuttrycket i två olika typer av testsystem.



Ett problem med siRNA är att de kan ha så kallade off target effekter. Det kan bero på att de utöver målsekvensen är komplementära till ytterligare mRNA, vilket leder till nedreglering av andra proteiner än det tänkta. Vi visade att siRNA som har ett platina-komplex bundet till den RNA sträng som inte togs upp av RISC, fortfarande var funktionella och att platinering av siRNA ledde till att så kallade off target effekter försvann. Vi visade också att effekten av cisplatin kan potentieras om det kombineras med siRNA mot ett lämpligt valt protein.



Polyaminer



I den här avhandlingen studerades några olika fuktionaliserade polyaminers påverkan på DNA med avseende på struktur och termodynamisk stabilitet. Vidare undersöktes om de hade någon påverkan på tillväxten i olika bröstcancercell-linjer.



Polyaminer är poly-katjoner, som finns i alla organismer. De viktigaste polyaminerna som finns i prokaryoter och eukaryoter är spermin4+, spermidine3+, och putrescine2+. Polyaminer är viktiga för cellulära processer som involverar celltillväxt och viabilitet. Polyaminmetabolismen regleras av såväl oncogener som tumörsuppressorer. Funktionaliserade polyaminer har också visat sig binda specifikt till olika RNA strukturer, vilket indikerar att de kan ha en reglerande effekt på RNA nivå. För över 40 år sedan konstaterades det att cancerceller ofta hade förhöjda polyamin halter. Förhöjda polyamin koncentrationer leder till ökad celldelning, minskad celldöd, samt ökat uttryck av gener som påverkar metastasering. Det är således av intresse att kontrollera polyamin metabolismen. Två olika strategier kan tillämpas för att åstadkomma detta. För det första kan man utnyttja specifik inhibering av de enzym som katalyserar polyamin produktionen, vilket i förlängningen leder till lägre polyaminkoncentrationer. Ett antal sådana har studerats kliniskt, men visat sig vara för toxiska. För det andra kan användning av strukturella polyamin-analoger vara ett alternativ. Sådana analoger skulle kunna nedreglera polyamin syntesen samtidigt som polyamin-katabolismen ökade, medan de själva inte kan delta i cellulära processer. Ett antal polyamin analoger har experimentellt visat sig ha anti cancer egenskaper i bröstcancer, prostata cancer, melanom och lungcancer modeller. Några finns också i klinisk prövning.



Det visade sig att de linjära polyaminerna, dit spermin och spermidin hör, ökar stabiliteten hos DNA. Detta kan lätt förklaras av att de positiva polyaminerna dras elektrostatiskt till de negativt laddade DNA strängarna, där de skärmar av de negativa laddningarna från varandra, vilket leder till ökad DNA stabilitet. De funktionaliserade polyaminerna miskade därmot stabiliteten hos DNA. Det kan förklaras med att polyaminerna var steriskt hindrade samt att substituenterna donerade fler elektroner till kvävena, vilket leder till minskad positiv laddning. Slutligen, studerades två polyaminer som var substituerade med en uridin eller adenin analog. De hade ingen påverkan på smältpunkten, men ändrade smältproflilen, vilket indikerar att de interagerar inte bara elektrostatiskt, som de enklare polyaminerna, utan också genom att interkalera mellan två baser. Ingen av polyaminerna visade sig ha någon toxisk effekt på cancercell-linjerna.

• author: Hägerlöf, Margareta
• supervisor: Sofi Elmroth
• opponent: Prof. Lippert, Bernhard, Universität Dortmund
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2007
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Kinetics, Kemi, Chemistry, AU-rich region, siRNA, Circular Dichroism, Polyamine, Modified Nucleoside, HPLC, Thermodynamic Stability, cisplatin, Hairpin, DNA and RNA conformation, RNA, DNA, Anticancer Drug, Platinum Complexes
• defense location: Hörsal B Chemical Center Sölvegatan 39 Lund
• defense date: 2007-05-11 10:30:00
• ISBN: 978-91-7422-158-9
• language: English
• LU publication?: yes
• id: ee7a4dd1-5f0d-45a7-81c2-454dbd3f2c49 (old id 548503)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:12:06
• date last changed: 2018-11-21 21:09:35