Type 2 Cystatins. Studies on the role of the major cystatin, cystatin C, in mice and on properties and distribution of the novel human cystatins F, G, H and I.

Abstract

The aim the thesis work was to study the human cystatins C, E/M, F, G, H and I both in vivo and in vitro. A mouse devoid of cystatin C was used for the cystatin C studies. The levels of cystatins C, E/M and F were measured in pleural effusion samples of patients with various lung disorders. Cystatin F protein and RNA levels were measured in the human haematopoietic cell line U937 as well as in cells isolated from human whole blood. The testis specific cystatin-like mRNA:s cystatin G, H and I were cloned and sequenced and cystatin G was expressed in a Pichia pastoris expression system. The recombinant protein was used to determine the inhibition of the cysteine peptidases papain, cathepsin B, H, L and S as well as mammalian legumain.



Mice devoid of cystatin C appear phenotypically normal and are fertile. Injection of a metastatic melanoma cell line gives fewer and smaller metastases in the lungs of the cystatin C-/- mice than in normal control mice. Cystatin E/M is significantly elevated in pleural fluid from patients with pleural mesotehliomas compared to both patients with secondary pleural tumours and patients with benign diseases. The cystatin F levels in pleural fluid are significantly elevated in patients with parapneumonia and tuberculosis compared to patients with malign and other benign disorders. The cystatin locus, covering ~1.7 Mb on chromosome 20p11.21, constitutes 13 cystatin genes of which three are pseudogenes. Cystatin F is an inhibitor specifically expressed in haematopoietic cells and its expression is readily regulated with ATRA or TPA. Both substances down-regulate the expression of the inhibitor. A comparably high portion of the protein is retained intracellularly. The inhibitor does not co-localize with ER in immunocytochemical staining but co-elutes with fractions containing elevated levels of the lysosomal enzyme, ß-hexosaminidase, after gradient ultracentrifugation. Among eight tested isolated blood cell types all but B-cells contained cystatin F but only eosinophilic granulocytes, monocytes and neutrophilic granulocytes contained cystatin C in significant amounts. Immunocytochemical staining of cells in whole blood shows that eosinophilic granulocytes gives the strongest cystatin F signal. ELISA quantitation demonstrates that eosinophilic granulocytes contain by far the highest levels of both inhibitors of all tested blood cell types. Recombinant cystatin G can be expressed in Pichia pastoris. The protein is secreted in one long and one short form. The long form was isolated and shown to be a tight-binding inhibitor of papain, the lysosomal cathepsins H, L and S, and of mammalian legumain but not of the lysosomal cathepsin B.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vår arvsmassa består av en cirka två meter lång tråd av DNA. Denna långa DNA-tråd är väl hoppackad och alla kärnbärande celler i kroppen har en kopia av den. Tråden kan delas upp i korta segment som utgör våra gener och mellanliggande segment vars uppgift inte är helt klarlagd. Totalt har vi enligt nuvarande beräkningar cirka 30 000 gener. Dessa gener, som innehåller koden för hur varje organism och individ är uppbyggd, kodar för proteiner. Ett protein består av ett antal aminosyror i en kedja som i sin tur är veckad till en tredimensionell struktur. Totalt har vi alltså ungefär 30 000 olika proteiner i kroppen. Proteiner kan vara allt från muskelproteiner som utför kontraktionsarbetet när vi rör oss till antikroppar som känner igen invaderande patogener och enzymer som har till uppgift att påskynda en viss kemisk reaktion i kroppen. Vissa enzymer har den specifika uppgiften att bryta ner proteiner, så kallade peptidaser. T.ex. bryter enzymet pepsin, som finns i magsäcken, ner proteiner som vi äter till mindre delar så att tarmen kan ta upp näringen. Andra proteinnedbrytande enzymer finns inne i våra celler och har specifika uppgifter där. Ett exempel är nedbrytning av bakterieproteiner som gör oss sjuka. Som så ofta i kroppen råder en jämvikt mellan verkan och motverkan. I fallet med peptidaser heter den motverkande kraften peptidashämmare, en typ av proteiner som inte bryts ner av peptidaserna utan istället hämmar deras aktivitet.



Peptidaserna är indelade i olika typer beroende på vilken aminosyra i proteinkedjan som är inblandad i den katalytiska processen att bryta ner ett protein. Därför kallas peptidaser med cystein som katalytisk aminosyra för cysteinpeptidaser och cysteinpeptidashämmare är följaktligen den familj av hämmare som hämmar just cysteinpeptidaserna.



Det finns idag i människan beskrivet tolv olika cystatiner och ytterligare tre proteiner tror man kan vara cystatiner. Jag har i mitt doktorandarbete studerat fyra av dem. I det första delarbetet (I) studerade vi genetiskt modifierade möss som inte har någon gen som kodar för cystatin C. Dessa möss är mycket lika vanliga möss men när vi injicerade cancerceller i dem kunde vi se en skillnad. En rådande teori är att en hög peptidasaktivitet är gynnsam för metastaserande tumörer. Det betyder att närvaron av en peptidashämmare skulle ge mindre metastasering. Men mössen som saknade cystatin C fick färre och mindre metastaser. Detta visar att cystatin C har en funktion kopplad till tillväxt av tumörer. Men cystatin C är den cystatin som det finns mest av i kroppen och därför är det märkvärdigt att en mus utan denna hämmare i övrigt verkar normal. Möjligtvis kan andra cystatiner fylla de funktioner cystatin C har om påverkan utifrån inte blir för stark (t.ex. av injicerade cancerceller).



I nästa delarbete (II) studerade vi därför flera cystatiner i pleuralvätska från patienter med olika lungsjukdomar, dels olika cancertyper och dels inflammatoriska sjukdomar. Vi kunde visa att mängden cystatin C inte varierade mellan patienter med olika diagnoser. Patienter med mesoteliom hade däremot högre halt cystatin E/M jämfört med andra patienter. Patienter med tuberkulos och paralunginflammation hade högre halter cystatin F än de patienter som hade andra typer av inflammatoriska sjukdomar. Dessutom var ett högt antal neutrofila granulocyter, en sorts immunförsvarsceller, korrelerat till ett förhöjt cystatin F-värde bland patienter med paralunginflammation.



Vi forsatte att studera cystatin F p.g.a. att den verkar vara involverad i immunförsvaret (delarbete III). Vi ville klarlägga hur cystatin F-genen ser ut och om man kan påverka produktionen av hämmaren i cellinjen U937. Arbetet med genen visade att den skiljer sig något i sin struktur jämfört med andra cystatingener. Genom tillsatser i det odlingsmedium vi odlade U937 i kunde vi, till skillnad från cystatin C, nedreglera produktionen av cystatin F. Vi upptäckte vidare att en stor del av det cystatin F som produceras finns inne i cellerna till skillnad från cystatin C, som utsöndras direkt efter produktion. Detta ledde till att vi studerade var i cellen hämmaren finns. Vi kunde visa att cystatin F inte finns i endoplasmatiska retikulum men möjligen i samma organeller som enzymet ß-hexosaminidas. Detta enzym finns i så kallade lysosomer, cellens sopstationer i vilka överflödiga och främmande proteiner bryts ner av olika peptidaser. Möjligtvis är en av huvudfunktionerna för cystatin F att medverka i regleringen av denna proteinnedbrytning.



Resultaten ledde oss att studera cystatin F i blodceller (delarbete IV). Vi gjorde blodutstryk av helblod på objektsglas och färgade cystatin F specifikt. På så sätt kunde vi utröna vilka blodceller som producerar mest cystatin F. Därefter isolerade vi olika typer av blodceller och kunde mäta produktionen och mängden hämmare i dem. Resultaten visade något förvånande att framför allt eosinofila granulocyter innehåller stora mängder cystatin F. Även de andra celltyperna vi testade innehöll cystatin F men inte i lika höga halter. Neutrofila granulocyter innehöll inte så höga halter men vi kunde visa att de producerade relativt mycket cystatin F. Här är en möjlig förklaring till den korrelation vi kunde se i delarbete II mellan cystatin F-värdet och antalet neutrofila granulocyter hos patienter med paralunginflammation.



I spåren av kartläggningen av hela den mänskliga arvsmassan har det blivit möjligt att med en elektronisk sökmotor hitta nya gener som liknar redan kända. Med hjälp av denna typ av databassökningar fann vi tre nya gener som kodar för potentiella cystatiner. För att utreda om de verkligen var cystatiner lät vi jästceller tillverka en av dem, cystatin G, genom att föra in en cystatin G-gen i jästcellernas arvsmassa. Enligt kvalificerade gissningar baserade på aminosyrasekvensen hos cystatin G, borde den inte kunna hämma aktiviteten hos cysteinpeptidaser. Men till vår förvåning var cystatin G en stark hämmare av flera peptidaser, bl.a. de så kallade cathepsinerna H, L och S. Även enzymet papain från papayaväxten som tjänar som modellenzym i denna typ av studier hämmades. Enzymet legumain som bara är en avlägsen släkting till cathepsinerna hämmades också vilket var mycket oväntat då cystatin G helt saknar den aminosyra som tros var avgörande för hämning av legumain.



Med detta arbete kunde vi alltså visa att en av de tre möjliga hämmarna, trots sin annorlunda aminosyrakedja, faktiskt kan hämma cysteinpeptidaser. Vilket i sin tur betyder att de delar av aminosyrakedjan som man trott vara essentiella för hämning inte är riktigt så viktiga.

• author: Nathanson, Carl-Michael
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Johansen, Harald Thideman, Dept. of Pharmacology, School of Pharmacy, University of Oslo, P.O. Box 1068 Blindern, 0316 Oslo, Norway
• organization: Division of Clinical Chemistry and Pharmacology
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry; Pharmacology and Toxicology
• keywords: Clinical chemistry, Klinisk kemi, enzyme kinetics, eosinophilic granulocytes, expression pattern, pleural effusion, knockout mouse, Cysteine peptidase, cystatin
• pages: 128 pages
• defense location: Segerfalkssalen, Wallenberg Neurocentrum, Lund
• defense date: 2002-11-28 10:15:00
• ISBN: 91-628-5491-7
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: 1. Huh C, Håkansson K, Nathanson C-M, Thorgeirsson UP, Jonsson N, Grubb A, Abrahamson M, Karlsson S. Decreased metastatic spread in mice homozygous for a null allele of the cystatin C protease inhibitor gene. Mol Pathol 1999; 52: 332-40 Article: 2. Werle B, Sauckel K, Nathanson C-M, Bjarnadottir M, Spiess E, Ebert W, Abrahamson M. Cystatins C, E/M and F in human pleural fluids of patients with neoplastic and inflammatory lung disorders. Biol Chem 2002 (in press) Article: 3. Nathanson C-M, Wassélius J, Wallin H, Abrahamson M. Regulated expression and intracellular localisation of cystatin F in U937 cells. Eur J Biochem 2002 (in press) Article: 4. Nathanson C-M, Wallin H, Egesten A, Håkansson K, Wassélius J, Abrahamson M. Cystatins F and C are differentially expressed and localised in native human blood cells: cystatin F is distinctly localised in eosinophilic granulocytes. Manuscript Article: 5. Nathanson C-M, Ni J, Abrahamson M. Cystatin G, the product of one of the cystatin-related genes expressed in human testis, is a potent cysteine peptidase inhibitor: Cloning of cystatin G, H and I cDNA; expression and characterization of cystatin G. Manuscript
• id: f65ef027-efca-45d9-8a73-5231ee6ebb0a (old id 465171)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:09:11
• date last changed: 2018-11-21 21:02:58