The EGF-like Modules of Anticoagulant Protein S. Studies of Ca2+ binding and module interactions

Abstract

Protein S functions as a cofactor to activated protein C (APC) in the degradation of factors Va and VIIIa. In plasma protein S circulates in two forms; 30-40 % circulates as free protein S molecules while the remaining 60-70 % exists in a 1:1 complex with C4b-binding protein (C4BP). Only the free form of protein S functions as a cofactor to APC. Protein S is a mosaic protein composed of four discrete modules; a g-carboxyglutamic acid (Gla)-containing module, a thrombin-sensitive module (TSR), four epidermal growth factor (EGF)-like modules and a C-terminal sex hormone binding globulin (SHBG)-like module. The Gla-module contains 11 Gla residues, which require vitamin K for their biosynthesis, and anchors the protein to the membrane. All four EGF-like modules contain another modified amino acid residue, erythro-b-hydroxyaspartic acid (Hya) or erythro-b-hyroxyasparagine (Hyn). The three C-terminal modules also contain a concensus sequence indicating Ca2+ binding. The C-terminal SHBG-like module contains the binding site for C4BP. The aim of this work has been to study the Ca2+ binding affinity of the EGF-like modules, and the involvement of these modules in interactions with other proteins. Fragments containing one, two, three or four EGF-like modules have been isolated. This includes the chemically synthesized single EGF modules 3 and 4. These two modules were also expressed as a pair in a procaryotic system and folded to a native conformation. EGF 1-4, EGF 1-3, EGF 2-3 and EGF 2-4 were expressed in a baculovirus based insect cell system. The Ca2+ affinity in the modules was determined either by NMR monitored titrations or using chromophoric chelators. We found that the single modules EGF 3 and 4 bound Ca2+ in the low mM range (Kd 6-9 mM). In the EGF 3-4 pair the N-terminal site binds Ca2+ with an affinity that is almost identical to that of free module 3, whereas the affinity of the C-terminal module is greatly enhanced. Compared to the single module the affinity is ~8600-fold higher for EGF 4 in the pair. It thus appears as if the major effect on Ca2+ binding is excerted by the module N-terminal of the Ca2+ binding one. EGF modules 1-4 and 2-4 each was found to contain two very high affinity Ca2+ binding sites; with Kd from 10-8 to 10-6 M, at physiological ionic strength. In contrast, the Ca2+ affinities of EGF 2-3 and EGF 1-3 is two to four orders of magnitude lower. These data imply that also modules C-terminal of the Ca2+ binding one influence the Ca2+ affinity. By using the recombinant EGF modules as inhibitors in a clotting assay, it was shown that the interaction between protein S and APC was mediated by recombinant fragments which contained the first EGF module (EGF 1-4 and EGF 1-3). Yet, EGF 1-4 had an almost 10-fold stronger inhibitory effect than EGF 1-3 for reasons that not yet understood. Using a solid-phase system a direct interaction between protein S and factor Xa was also observed. The Ca2+ binding studies, as well as the experiments where the interactions of protein S were studied indicated that module-module interactions are crucial to the biological function of protein S.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

I samband med en kärlskada startar en kaskad av reaktioner som leder fram till bildandet av ett blodkoagel. Det är viktigt att bildandet av blodkoagel begränsas till det skadade området. Blodkoagulationen är därför reglerad av antal antikoagulanta system av vilka det viktigaste är protein C systemet. I detta system samverkar aktivt protein C (APC) tillsammans med ett annat protein, kallat protein S. En brist på endera av dess två proteiner medför en ökad risk att drabbas av blodpropp. Protein S är uppbyggt av fyra olika regioner, s. k. moduler (schematiskt illustrerad i figur 5 på sidan 22). Den första modulen innehåller karboxylerade glutaminsyror (Gla), en speciell aminosyra som kräver vitamin K för att bildas. Gla- modulen ansvarar för bindningen av protein S till de negativt laddade ytor som exponeras på blodplättar (trombocyter) och cellmembraner från skadade celler. Nästa del av molekylen består av den thrombin känsliga delen. Protein S kan här klyvas av thrombin, ett enzym i blodet som främjar koagulationen. En klyvning i denna region medför att protein S ej längre kan fungera som hämmare av blodkoagulationen. Den tredje regionen består av fyra moduler som var och en liknar den epidermala tillväxtfaktorn (EGF). EGF är ett litet protein som stimulerar differentieringen av vissa celltyper, en egenskap som saknas hos de EGF-lika modulerna i protein S. I de fyra EGF-lika modulerna finns ytterligare modifierade aminosyror, b-hydroxyasparagin (Hyn) och b-hydroxyaspartat (Hya). Den fjärde och sista delen av proteinet består av en modul som kallas för SHBG-delen och som liknar ett protein i kroppen som heter SHBG ‘sex hormone binding globulin‘. SHBG fungerar som transportprotein för manligt könshormon i blodet. Någon liknade funktion av SHBG-delen i protein S har ej dokumenterats. Däremot är denna del involverad i bindningen till ett annat protein, C4b-bindande protein (förkortat C4BP), vilket är en del av kroppens immunförsvar. I blodet cirkulerar 30-40 % av protein S som fria molekyler medan resterande 60-70 % återfinns bundna till C4BP. Endast den delen av protein S som cirkulerar som fria molekyler fungerar som koagulationshämmare, dvs de 60-70 % som befinner sig i komplex med C4BP påverkar ej koagulationen. Denna avhandling behandlar framförallt EGF-modulernas kalciumbindande förmåga och deras delaktighet i interaktioner mellan protein S och andra proteiner i blodkoagulationen. För att kunna studerea detta isolerades de EGF-lika modulerna i protein S antingen var för sig eller i kombination. De ensamma modulerna EGF 3 och 4 syntetiserades kemiskt och veckades till en nativ konformation. Med hjälp av baculovirus i insektceller producerades EGF 1-4, EGF 1-3, EGF 2-3 och EGF 2-4. Dessa protein fragment karakteriserades med avseende på konformation, renhet och Hya/Hyn-innehåll. Då insektcellerna ej kunde vecka EGF 3-4, producerades detta par i bakterier varefter modulerna veckades till nativ konformation. För att bestämma kalciumaffiniteten hos de enskilda modulerna och de EGF innehållande fragmenten användes NMR-teknik (kärnmagnetisk resonans) samt metoder som utnyttjar kromofora kelatorer. Detta har gjort det möjligt att vis att de ensamma EGF-lika modulerna 3 och 4 i protein S innehåller var sitt kalciumbindande site (ung. ställe, ficka) med relativ svag affinitet. Kalciumaffiniteten är i samma styrka som tidigare har dokumenterats för ensamma EGF-lika moduler från andra koagulationsproteiner. När kalciumaffiniteten studerades i EGF 3-4 paret visade det sig däremot att affiniteten i det C-terminala sitet (slutet av molekylen, i detta fall EGF 4) hade ökat 8600 ggr jämfört med affiniteten i den ensamma modulen. Det kalciumbindande sitet i EGF 3 binder dock med samma affinitet i paret och som ensam modul. Därmed framgår det att den huvudsakliga effekten på kalciumbindning skapas av modulen N-terminalt (framför) om den som binder. När EGF 1-4 och 2-4 undersöktes fann jag bl.a. att dessa fragment innehåller två mycket högaffina kalciumbindande site, med 1000-100 000 ggr högre affinitet för kalcium än motsvarande ensamma EGF-lika moduler. Dessa två site tros befinna sig i modul 3 och 4. Om EGF 4 däremot saknas, såsom i fragment EGF 1-3 och 2-3, uteblir den mycket höga kalciumaffiniteten i EGF 3. EGF 4 tycks således ha den högsta kalciumaffiniteten och den påverkar affiniteten i EGF 3 med en faktor av ~230 och EGF 2 med en faktor av ~25. Detta tyder på att också moduler C-terminalt (efter) om den kalciumbindande modulen påverkar kalciumaffiniteten. Fragmenten utnyttjades också för att studera om och i så fall vilka av de EGF-like modulerna i protein S som är involverade i interaktionen med APC. Med hjälp av en metod som registrerar hur lång tid det tar för plasma att koagulera, studerades fragmentens förmåga att tränga undan bindningen mellan protein S och APC. Endast de fragment som innehöll EGF 1 hade förmågan att påverka interaktionen. EGF 1-4 hade dessutom en 10 ggr starkare inhibitorisk effekt än EGF 1-3. Det tyder antingen på att det finns en svag interaktion mellan EGF 4 och APC eller att EGF 4 behövs för att hålla EGF 1 i en optimal konformation för interaktion med APC. Då en antikoagulant aktivitet, oberoende av APC, tidigare hade föreslagits för protein S användes fragmenten och de ensamma modulerna även för att studera en eventuell interaktion mellan protein S och faktor X (ett av de prokoagulanta proteinerna). I ett fast fas system lyckades alla EGF fragmenten utkonkurrera intakt protein S i dess interaktion med faktor X, medan ingen påverkan kunde påvisas med de ensamma modulerna. Ej heller sågs någon effekt av felveckat EGF 3-4 eller av ett kalciumbindande EGF modulpar från ett orelaterat protein. Den fysiologiska relevansen av en protein S-faktor X interaktion är dock fortfarande oklar. De kalciumbindande studierna liksom experimenten där interaktionerna mellan protein S och andra proteiner studerades indikerade att modul-modul interaktioner är viktiga för den biologiska funktionen av protein S.

• author: Stenberg, Yvonne
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Handford, Penny A, University of Oxford
• organization: Clinical Chemistry, Malmö (research group)
• publishing date: 1999
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry
• keywords: enzymology, Proteins, Klinisk kemi, Clinical chemistry, calcium binding, Protein S, EGF-like module, Proteiner, enzymologi
• pages: 166 pages
• defense location: Jubileums aulan, Medicinskt Forskningscentrum, ing 59, Universitetssjukhuset MAS, Malmö
• defense date: 1999-04-15 13:00:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECM--1020--SE
• language: English
• LU publication?: yes
• id: fe5ea352-77a5-4341-b93c-5b27d88b5296 (old id 39387)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:25:25
• date last changed: 2018-11-21 21:10:52