Thioflavin T as a Structural Probe for GLP-1 Analog Self-Association in Standard Buffer and Biorelevant Gastrointestinal Environments

Abstract

Peptide therapeutics offer advantages in specificity and affinity, yet the potential propensity to self-associate and aggregate poses a challenge for the development of stable oral formulations. This master’s thesis evaluates the utility of the fluorescent dye Thioflavin T as a structural probe to monitor the aggregation of glucagon-like peptide-1 receptor agonists, specifically Liraglutide and Semaglutide. Using a multi-method analytical workflow, the self-association behavior of high-concentration (1 mM) peptide solutions was examined in a standard, neutral phosphate buffer and in biorelevant complex media simulating gastrointestinal environments.

The results indicate that 1 mM Liraglutide immediately self-associate into oligomeric structures upon dissolution across all studied environments. Over 24 hours, the aggregation pathways diverge significantly depending on the medium. In neutral phosphate buffer, a correlated increase in Thioflavin T emission intensity, quenching of intrinsic Liraglutide tryptophan fluorescence, and a red-shifted absorbance in ultraviolet-viable spectroscopy absorbance suggest that Liraglutide forms stable, hydrophobic micellar structures. Comparative evaluations indicate, in the conditions studied, that Semaglutide remains relatively stable over 24 hours with no significant structural transitions.

The complexity in evaluating Thiflavin T’s diagnostic results is concluded to be heavily dependent on the environment. While highly effective in simple buffers, Thioflavin T's detection capability is intricate in complex biorelevant media. In the fasted state simulated intestinal fluid, large aggregate clusters undergo physical sedimentation, artificially dropping the ThT signal. In low pH environments, fed state simulated intestinal and fasted state simulated gastric fluid, suspected high ordered β-sheet formation and precipitation trigger massive right-angle light scattering spikes and structural change that plateau or compromise the Thioflavin T emission signaling. Consequently, this study underlines the challenges in using the ThT assay in complex matrices but highlights the value and opportunity of combining them in a multi-method approach for oral peptide drug characterization.

Popular Abstract (Swedish)

Peptider utgör en särskild grupp av läkemedel som har förmågan att effektivt påverka interaktioner mellan proteiner i kroppen, som till exempel enzymer. Till skillnad från läkemedel med små molekyler som aktiv substans kan de större peptider agera mångsidigt och mer exakt för att generera önskad effekt. Peptidläkemedel erbjuder därmed betydande fördelar när en aktiv substans med hög specificitet och stark affinitet till målproteinerna krävs. Nackdelen med peptider är dock deras tendens att aggregera, alltså att gå ihop och bilda större och komplicerade strukturer i olika former. När läkemedlet aggregerar riskerar det att orsaka minskad upptagningsförmåga i kroppen och att dess biologiska funktion minskar eller förloras.

Högaktuellt i läkemedelsvärlden just nu är utveckling av peptidläkemedel i oral tablettform. En problematik för denna utveckling är dock just peptidernas starka tendens att aggregera när de möter den komplexa miljön i mag-tarmkanalen. Detta är alltså ett viktigt hinder att överkomma för att ta fram tablettbaserade peptid-produkter. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analoger är en grupp peptider involverade i denna områdesutveckling. De används för behandling av diabetes och fetma och inkluderar bland annat det omtalade läkemedlet Ozempic™ av Novo Nordisk.

Så för att kunna designa stabila orala läkemedelsformuleringar krävs analysmetoder som kan övervaka strukturella förändringar hos peptiderna. Detta arbete har adresserat detta behov genom att utvärdera funktionen hos det fluorescerande ämnet Thioflavin T (ThT) som en detektor för aggregering av GLP-1-analoger i mag- och tarmmiljöer.

Det experimentella fokuset har legat på att generera unika resultat genom att jämföra hur aggregeringen fortskrider för höga koncentrationer av peptid i en enkel, neutral fosfatlösning jämfört med i komplexa, simulerade mag- och tarmvätskor. För att få en helhetsbild av processerna har traditionella ThT mätningar kombinerats med en rad kompletterande metoder som bland annat testat storlek på partiklar och förändringar i färgnyans i provet. Resultaten visar att färgämnets rapporteringsförmåga är starkt beroende av den omgivande miljön men att ThT är en bra detektor för aggregering av GLP-1 analoger i enkelt lösningsmedel. De visade även att en av peptiderna troligtvis bildar olika sorters strukturer i det enkla lösningsmedlet och de simulerade mag- och tarmvätskorna.

Denna studie bidrar med nytta och tillämpning genom att kartlägga de möjligheter som finns i kombinationen av ThT och aggregering av GLP-1 analoger. Både i enkla och komplicerade miljöer. Men även de begränsningar som uppstår när standardiserade analysmetoder flyttas från enkla laboratoriemiljöer till komplexa biologiska system.

• author: Persson Skansjö, Elsa
• supervisor: Cedric Dicko; Andreas Hugerth
• organization: Pure and Applied Biochemistry
• alternative title: Thioflavin T som strukturell markör för självassociation hos GLP-1-analoger i standardlösning och biorelevant mag-tarmmiljö
• course: KBKM05 20261
• year: 2026
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering; Biology and Life Sciences
• keywords: Applied biochemistry, Thioflavin T, Liraglutide, Biorelevant media
• language: English
• id: 9232506
• date added to LUP: 2026-06-18 12:02:31
• date last changed: 2026-06-18 12:02:31