Advanced

Luciferase Expression Vectors For Analyzing RNA Interference within the MYCN 3'UTR

Andersson, Andreas LU (2012) KEMX03 20121
Department of Chemistry
Abstract
The gene MYCN encodes a transcription factor with a fundamental role in many neuroendocrine tumors, especially neuroblastoma. The gene and protein are very similar to the closely related c-Myc protein, except for the 3´untranslated region (3´UTR), suggesting that it may be an important factor in determining their very different expression pattern at the post-transcriptional level. MicroRNA (miRNA) are small non-coding RNA that bind to the 3´UTR and prevent translation of their target mRNA. Targets can be predicted with computational algorithms, but the number of targets seems to be greatly overestimated. The target sequence of several interesting miRNAs exist in the MYCN 3´UTR that may explain its regulation and deregulation. To test if... (More)
The gene MYCN encodes a transcription factor with a fundamental role in many neuroendocrine tumors, especially neuroblastoma. The gene and protein are very similar to the closely related c-Myc protein, except for the 3´untranslated region (3´UTR), suggesting that it may be an important factor in determining their very different expression pattern at the post-transcriptional level. MicroRNA (miRNA) are small non-coding RNA that bind to the 3´UTR and prevent translation of their target mRNA. Targets can be predicted with computational algorithms, but the number of targets seems to be greatly overestimated. The target sequence of several interesting miRNAs exist in the MYCN 3´UTR that may explain its regulation and deregulation. To test if these targets are true, an in vitro approach with a plasmid-encoded reporter gene can be used. Here, the MYCN 3´UTR has been inserted downstream of the firefly luciferase gene. Renilla luciferase, on the same plasmid or separate, is used as a control. Three plasmids with different insert lengths were generated. (Less)
Abstract (Swedish)
Populärvetenskaplig sammanfattning
Genen MYCN kodar för N-Myc, ett protein som fungerar som transkriptionsfaktor, det vill säga det kontrollerar vilka gener som transkriberas aktivt från DNA till RNA. Många neuroendokrina tumörer, speciellt neuroblastoma, uppvisar ofta onormalt höga nivåer av N-Myc, och eftersom N-Myc startar transkriptionen av många gener som är viktiga för cellens delning, tillväxt och mobilitet, skulle det kunna vara en bidragande orsak till cancerutveckling. Både genens och proteinets struktur är mycket lika de för det närbesläktade c-Myc, med undantag för den 3´icke-translaterade regionen (3´UnTranslated Region, 3´UTR). När messenger RNA (mRNA) translateras till protein är det inte allt som kodar för protein och den... (More)
Populärvetenskaplig sammanfattning
Genen MYCN kodar för N-Myc, ett protein som fungerar som transkriptionsfaktor, det vill säga det kontrollerar vilka gener som transkriberas aktivt från DNA till RNA. Många neuroendokrina tumörer, speciellt neuroblastoma, uppvisar ofta onormalt höga nivåer av N-Myc, och eftersom N-Myc startar transkriptionen av många gener som är viktiga för cellens delning, tillväxt och mobilitet, skulle det kunna vara en bidragande orsak till cancerutveckling. Både genens och proteinets struktur är mycket lika de för det närbesläktade c-Myc, med undantag för den 3´icke-translaterade regionen (3´UnTranslated Region, 3´UTR). När messenger RNA (mRNA) translateras till protein är det inte allt som kodar för protein och den icke-kodande sekvensen som ligger efter mRNAts stopkodon kallas 3´UTR. Att just den sekvensen skiljer sig så mycket mellan N-Myc och c-Myc antyder att den skulle kunna vara viktig när det gäller bestämmandet av det vitt skillda uttrycket mellan dem, speciellt med tanke på att 3´UTR är den regionen som är utsatt för den största andelen av mRNA reglering. MicroRNA (miRNA) är små, icke-kodande RNA som binder till 3´UTR och förhindrar translation av mRNA. Datorbaserade algoritmer kan förutsäga vilket mRNA som de binder till, men dessa beräkningar tycks göra en grov överskattning av deras antal. Datorprogrammen är därför en bra indikation på vilka interaktioner som skulle kunna ske, men de kan inte ge någon säker information. Inbindningssekvenserna för flera intressanta miRNA är beräknade till att befinna sig i MYCNs 3´UTR och skulle kunna föklara dess reglering. Vissa av dessa miRNA är sedan tidigare kända för att reglera cellulära processer med motsatt utgång i förhållande till N-Myc. Vissa ligger i en kromosomal region som ofta har blivit förlorad i neuroblastoma celler. Ifall det skulle visa sig att de förhindrar N-Myc protein från att bildas skulle detta ge en klarare av hur N-Myc interagerar i cellen. För att undersöka detta sattes här olika delar av MYCNs 3´UTR in nedanför eldfluge-luciferasgenen på en plasmid. Plasmider är små cirkulära DNA-molekyler som kodar endast för ett fåtal protein. Luciferas är ett enzym som skapar luminiscens och dess aktivitet kan mätas med en luminometer. När MYCN 3´UTR sätts in efter dess stopkodon påverkar regleringen av denna (t.ex genom miRNA) hur mycket av luciferasets mRNA som hindras från att translateras. På detta sätt skapades en reporterplasmid som visar hur MYCN skulle kunna regleras av miRNA när den transfekteras in i humana celler.Transfektion med en miRNA prekursor eller inhibitor av samma cell som har plasmiden kan visa effekten av denna på mängden luciferasprotein. Renilla-luciferas, ett annat luciferas från sjöpennan Renilla reniformis används som en kontroll för transfektioneffektiviteten. Denna kodas antingen från samma plasmid eller från en helt annan. Tre olika plasmider konstrurerades i detta syfte och testades med siRNA, en motsvarigheten till miRNA som ofta används för att på konstgjord väg blockera translationen av det mRNA de binder till. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Andersson, Andreas LU
supervisor
organization
alternative title
Kloning och amplifiering av Myc-N innehållande plasmider, samt intereferensstudier med siRNA
course
KEMX03 20121
year
type
M2 - Bachelor Degree
subject
keywords
biokemi
language
English
id
3232419
date added to LUP
2012-12-07 16:57:00
date last changed
2012-12-07 16:57:00
@misc{3232419,
  abstract     = {The gene MYCN encodes a transcription factor with a fundamental role in many neuroendocrine tumors, especially neuroblastoma. The gene and protein are very similar to the closely related c-Myc protein, except for the 3´untranslated region (3´UTR), suggesting that it may be an important factor in determining their very different expression pattern at the post-transcriptional level. MicroRNA (miRNA) are small non-coding RNA that bind to the 3´UTR and prevent translation of their target mRNA. Targets can be predicted with computational algorithms, but the number of targets seems to be greatly overestimated. The target sequence of several interesting miRNAs exist in the MYCN 3´UTR that may explain its regulation and deregulation. To test if these targets are true, an in vitro approach with a plasmid-encoded reporter gene can be used. Here, the MYCN 3´UTR has been inserted downstream of the firefly luciferase gene. Renilla luciferase, on the same plasmid or separate, is used as a control. Three plasmids with different insert lengths were generated.},
  author       = {Andersson, Andreas},
  keyword      = {biokemi},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Luciferase Expression Vectors For Analyzing RNA Interference within the MYCN 3'UTR},
  year         = {2012},
}