Oxidative modifications of human S100A9

Abstract

The aim of this project was to examine how S100A9 binding to target molecules was affected by structural modifications with oxidizing agent in vitro.
S100A9 was cultivated, purified and oxidative modifications were induced. The oxidative modifications where characterized with tryptohan fluorescence, Surface Plasmon Resonance technique (SPR) and MALDITOF-MS.
To get access to protein to study recombinant human S100A9 was expressed in E.coli and purified in three chromatographic steps.
Tryptophan fluorescence measurements gave decreased fluorescence signal that correspond to increased oxidizing levels of HOCl or H2O2 added to rhS100A9.
SPR confirmed rhS100A9 correct folding against EMMPRIN or RAGE and a decreasing complex formation between rhS100A9 and antirhS100A9 antibody in presence of H2O2 and HOCl.
MALDI-TOF-MS demonstrate methionine sulfoxide formation of M63, M81, M83, M93 in the presence of HOCl or H2O2 in vitro.
The conclusion was that oxidative modification could be induced and characterized in S100A9 with tryptophan fluorescence and MALDI-TOFMS. SPR showed that the function of S100A9 in terms of binding ability to a receptor, decreased when oxidizing agents were added.

Abstract (Swedish)

Populärvetenskaplig sammanfattning
Oxidativa modifieringar av S100A9 S100A9 är ett protein i kroppen som får en förändrad struktur och funktion när det reagerar med syre. De strukturella förändringarna kallas oxidativa
modiferingar. För att förstå processen skulle man kunna jämföra S100A9 med järn. När järn kommer i kontakt med syre får det en rödaktig färg och strukturen går från att vara stark till att bli skör och vittra sönder. Det är det här som kallas för att järnet rostar. När S100A9 reagerar med syret i kroppen blir aminosyrorna, proteinets byggstenar, förändrade och det påverkar i sin tur hela proteinets struktur.
Syret i kroppen produceras främst av immunförsvaret för att skydda kroppen från angrepp från bakterier och virus. Proteiner och andra molekyler som reagerar med syret blir icke-funktionella i angriparna. Syret kan även ge sig på och skada kroppens egna celler. För att förhindra att syret bryter ner vävnader i kroppen plockar S100A9 upp syret. Syret
i S100A9 kan därefter oskadliggöras med hjälp av vissa processer, så att S100A9 får tillbaka sin ursprungliga struktur. Ibland kan inte syret plockas bort från S100A9 och då blir proteinet icke-funktionellt.
I det här arbetet har inverkan av syre på S100A9 undersökts i provrör. S100A9 har analyserats med avseende på vilka strukturella förändringar som sker och hur dessa påverkat proteinets funktion.
Strukturen har undersökts med två olika metoder; Tryptofanfluorescens och MALDI-TOF-MS. Tryptofanfluoresens innebär att man mäter det ljus som aminosyran tryptofan återutsänder när den bestrålas med ljus av en viss våglängd. Förändringar i ljussignalen berättar att strukturen runt tryptofan och proteinets struktur har ändrats. MALDI-TOFMS är en metod där man kan titta på enskilda aminosyror i proteinet och ser om de har bundit in syremolekyler eller fått andra förändringar.
S100A9 förmåga att binda till andra proteiner har undersökts med hjälp av metoden Surface Plasmon Resonance technique(SPR).
Studien visade att S100A9 fick oxidativa modifieringar som skulle kunna tillbakabildas. Modifieringarna var beroende av vilken mängd och vilken typ av syre som tillsattes; HOCl eller H2O2. En högre koncentration syre gav en större signalnergåang i fluorescensmätningarna. MALDITOF-MS visade att aminosyran metionin fick inbundet syre. SPR gav en minskad inbindningsförmåga mellan S100A9 och ett annat protein i närvaro av syre.

• author: Carlsson, Karin
• supervisor: Leif Dahlberg
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMT10 20132
• year: 2014
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Chemistry
• keywords: Protein Science, Proteinvetenskap
• language: English
• id: 4406790
• date added to LUP: 2014-04-25 10:29:02
• date last changed: 2014-04-25 10:29:02