Purification and Co-crystallization of Dihydroorotate dehydrogenase from Plasmodium falciparum with inhibitors
(2014) KEMR35 20141Department of Chemistry
- Abstract
- Malaria is one of the diseases that spread by insect vectors. The disease is carried to humans by female Anopheles mosquitoes. It is caused by the plasmodium types. The most prevalent and dangerous type of plasmodium is Plasmodium falciparum (Pf). The disease occurs in 104 countries and approximately 216 million new cases of malaria and around 655,000 deaths takes place every year. Many drugs have been developed against malaria, but unfortunately a lot of cases of malaria parasites’ resistance to these drugs have been recorded in many malaria regions, indicating a need for new drugs. The polyamine and pyrimidine biosynthesis pathways are highlighted as drug targets, due to their importance for the survival and reproduction of the... (More)
- Malaria is one of the diseases that spread by insect vectors. The disease is carried to humans by female Anopheles mosquitoes. It is caused by the plasmodium types. The most prevalent and dangerous type of plasmodium is Plasmodium falciparum (Pf). The disease occurs in 104 countries and approximately 216 million new cases of malaria and around 655,000 deaths takes place every year. Many drugs have been developed against malaria, but unfortunately a lot of cases of malaria parasites’ resistance to these drugs have been recorded in many malaria regions, indicating a need for new drugs. The polyamine and pyrimidine biosynthesis pathways are highlighted as drug targets, due to their importance for the survival and reproduction of the parasites. One of the key enzymes in the polyamine biosynthesis pathways of Plasmodium falciparum is spermidine synthases (SpdS), while in the pyrimidine biosynthesis pathways it is the dihydroortate dehydrogenase (DHODH). The enzyme DHODH catalyzes the fourth step in the pyrimidine biosynthesis pathways. The conversion of dihydrorotate to orotic acid, while the SpdS converts putrescine to spermidine in the polyamine biosynthesis pathway.
The aim of this project is to crystallize PfDHODH with different ligands. The co-crystallization technique requires using different methods (such as enzyme assay) to optimize various conditions, and also requires testing ligand binding when new molecules are available by using Differential Scanning Fluorimetry (DSF). In addition, we used Dynamic Light Scattering (DLS) to optimize protein buffer conditions and prevent protein aggregation. (Less) - Popular Abstract (Swedish)
- Malaria är en av de tropiska sjukdomarna som utgör ett stort hälsoproblem i många delar av världen. Sjukdomen orsakas av en så kallad tropisk parasit av släkte Plasmodium och överförs till människor via mygghonan Anopheles. Den vanligaste och mest dödliga formen av sjukdomen orsakas av Plasmodium falciparum (Pf). Den förekommer i 104 länder där ca. 216 miljoner nya fall registreras årligen. Av dessa leder ca. 655,000 fall till döden, mest bland barn.
För närvarande har flera kända läkemedel mot sjukdomen blivit verkningslösa beroende på att malariaparasiten har utvecklat resistens. Detta medför en akut behov av nya läkemedel. Enzymer inom pyrimidinbiosynteskedjan har tidigare utpekats som möjliga mål i utvecklingen av nya läkemedel mot... (More) - Malaria är en av de tropiska sjukdomarna som utgör ett stort hälsoproblem i många delar av världen. Sjukdomen orsakas av en så kallad tropisk parasit av släkte Plasmodium och överförs till människor via mygghonan Anopheles. Den vanligaste och mest dödliga formen av sjukdomen orsakas av Plasmodium falciparum (Pf). Den förekommer i 104 länder där ca. 216 miljoner nya fall registreras årligen. Av dessa leder ca. 655,000 fall till döden, mest bland barn.
För närvarande har flera kända läkemedel mot sjukdomen blivit verkningslösa beroende på att malariaparasiten har utvecklat resistens. Detta medför en akut behov av nya läkemedel. Enzymer inom pyrimidinbiosynteskedjan har tidigare utpekats som möjliga mål i utvecklingen av nya läkemedel mot malariaparasiten. Inhibering av en så kallad mål-molekyl påverkar vanligtvis överlevnad och reproduktion av parasiten. Ett av de nyckelenzymerna i pyrimidinbiosynteskedjan är dihydroorotatdehydrogenas (DHODH), som katalyserar omvandlingen av dihydroorotat till orotat.
Syftet med detta projekt var kristallisering av P. falciparum DHODH i komplex med olika ligander. Vid kristallisering av proteiner använder man olika biofysikaliska metoder för att optimera kristallisationsbetingelserna. Till exempel med så kallad Differential Scanning Fluorimetri (DSF) kan man undersöka om ligand binder till proteinet, medan Dynamisk Ljusspridning (DLS) används till att optimera buffertsammansättningen för att förhindra proteinaggregering.
Flera nyproducerade föreningar har utvecklats med hjälp av virtuell screening och strukturbaserad läkemedeldesign. Potensen hos dessa föreningar (förmågan att hämma enzymet) uppskattades med hjälp av IC50-värden. Intervallen av IC50-värden för de undersökta föreningarna varierade mellan 300 nm och ≥ 250 µm, medan en del andra föreningar visade sig vara oförmögna att inhibera enzymet. Selektiviteten testades också för de hämmare som hade IC50 mellan 300 nm och 50 µm. Detta uppnåddes genom att skanna dessa hämmare mot humana enzymet (HsDHODH). Ingen av dessa föreningar visade dock aktivitet mot HsDHODH.
En förening med arbetsbeteckningen AA_237729, som visade sig ha det lägsta IC50 värde valdes för kristallisering med PfDHODH. Kristaller som växte i dropparna hade en rektangulär form med dimensioner runt 0,05 mm x 0,04 mm. Dessa kommer att testas vid ett senare tillfälle i Röntgenstrålning. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/4780555
- author
- Mouefaq Said Al-Salehi, Ali LU
- supervisor
-
- Ingela Fritzson LU
- Erik Hallin LU
- organization
- course
- KEMR35 20141
- year
- 2014
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- keywords
- molekylär biofysik, molecular biophysics
- language
- English
- id
- 4780555
- date added to LUP
- 2014-11-19 11:53:30
- date last changed
- 2014-11-19 11:53:30
@misc{4780555,
abstract = {{Malaria is one of the diseases that spread by insect vectors. The disease is carried to humans by female Anopheles mosquitoes. It is caused by the plasmodium types. The most prevalent and dangerous type of plasmodium is Plasmodium falciparum (Pf). The disease occurs in 104 countries and approximately 216 million new cases of malaria and around 655,000 deaths takes place every year. Many drugs have been developed against malaria, but unfortunately a lot of cases of malaria parasites’ resistance to these drugs have been recorded in many malaria regions, indicating a need for new drugs. The polyamine and pyrimidine biosynthesis pathways are highlighted as drug targets, due to their importance for the survival and reproduction of the parasites. One of the key enzymes in the polyamine biosynthesis pathways of Plasmodium falciparum is spermidine synthases (SpdS), while in the pyrimidine biosynthesis pathways it is the dihydroortate dehydrogenase (DHODH). The enzyme DHODH catalyzes the fourth step in the pyrimidine biosynthesis pathways. The conversion of dihydrorotate to orotic acid, while the SpdS converts putrescine to spermidine in the polyamine biosynthesis pathway.
The aim of this project is to crystallize PfDHODH with different ligands. The co-crystallization technique requires using different methods (such as enzyme assay) to optimize various conditions, and also requires testing ligand binding when new molecules are available by using Differential Scanning Fluorimetry (DSF). In addition, we used Dynamic Light Scattering (DLS) to optimize protein buffer conditions and prevent protein aggregation.}},
author = {{Mouefaq Said Al-Salehi, Ali}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Purification and Co-crystallization of Dihydroorotate dehydrogenase from Plasmodium falciparum with inhibitors}},
year = {{2014}},
}