Advanced

Purification and Characterization of Soluble Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE)

Tuvesson, Jonas LU (2016) KEMZ03 20161
Department of Chemistry
Abstract
In this study a method for small scale purification of the protein RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) was developed and soluble RAGE was purified from bovine and mice tissue. In healthy animals RAGE is expressed in measurable levels only in lungs and therefore lungs have been used. The tissue was homogenized and thereafter RAGE was purified using Concanavaline A (Con A)-Sepharose, Heparin-Sepharose and ion-exchange chromatography. The purified proteins were identified and characterized by electrophoresis, Western blotting and mass spectrometry. Also one RAGE ligand, S100A9, could be purified, from the flow through from the Con A-Sepharose column. Binding activity and functionality of the proteins were tested using surface... (More)
In this study a method for small scale purification of the protein RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) was developed and soluble RAGE was purified from bovine and mice tissue. In healthy animals RAGE is expressed in measurable levels only in lungs and therefore lungs have been used. The tissue was homogenized and thereafter RAGE was purified using Concanavaline A (Con A)-Sepharose, Heparin-Sepharose and ion-exchange chromatography. The purified proteins were identified and characterized by electrophoresis, Western blotting and mass spectrometry. Also one RAGE ligand, S100A9, could be purified, from the flow through from the Con A-Sepharose column. Binding activity and functionality of the proteins were tested using surface plasmon resonance (SPR). Three different RAGE purifications were performed, resulting in 0.3 to 1 mg of soluble RAGE with a purity of 88 to 96%. SPR analysis revealed species-specific binding of antibodies, and binding of the RAGE ligand S100A9 demonstrated a highly conserved functionality. The developed purification protocol constitutes a valuable tool for understanding RAGE and its ligands. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Vid t.ex. höga blodsockervärden kan socker binda in till proteiner och bilda försockrade proteiner s.k. advanced glycation endproducts (AGE). AGE proteiner anses vara en viktig faktor i åldrande och i nedbrytande sjukdomar som diabetes och Alzheimers sjukdom. Ligander är molekyler som binder till specifika receptorer på cellytan och därigenom skickar signaler in i cellen. Receptorn för AGE proteiner (RAGE) har fått sitt namn just efter förmågan att binda AGE. Det har dock visat sig att RAGE har många andra ligander och att många av dessa associeras till autoimmuna sjukdomar och cancer. RAGE finns dels som en full-längds receptor integrerad i cellmembranet och dels som en löslig receptor. Den lösliga receptorn saknar transmembrandelen men... (More)
Vid t.ex. höga blodsockervärden kan socker binda in till proteiner och bilda försockrade proteiner s.k. advanced glycation endproducts (AGE). AGE proteiner anses vara en viktig faktor i åldrande och i nedbrytande sjukdomar som diabetes och Alzheimers sjukdom. Ligander är molekyler som binder till specifika receptorer på cellytan och därigenom skickar signaler in i cellen. Receptorn för AGE proteiner (RAGE) har fått sitt namn just efter förmågan att binda AGE. Det har dock visat sig att RAGE har många andra ligander och att många av dessa associeras till autoimmuna sjukdomar och cancer. RAGE finns dels som en full-längds receptor integrerad i cellmembranet och dels som en löslig receptor. Den lösliga receptorn saknar transmembrandelen men binder ligander på samma sätt som full-längds RAGE. För att kunna undersöka RAGE och dess ligander behöver RAGE renas fram. Vanligtvis görs detta från genetiskt modifierade celler, men som ett komplement till detta kan biologiskt aktiva proteiner renas fram från lämplig vävnad. Eftersom lungor är den enda vävnad med ständigt uttryck av RAGE har lösligt RAGE i denna studie renats fram från tre olika lungvävnader: lungor från kor, lungor från tumörbärande möss och lungor från friska möss. Lungvävnaden har först sönderdelas(homogeniserats) och därefter centrifugerats. Vid centrifugeringen separeras membranbundet RAGE från det som finns i den lösliga delen av cellen. Lösligt RAGE har därefter renats fram ur vätskan med hjälp av kromatografiska metoder. Vid kromatografi separerar man olika ämnen, t.ex. proteiner, från varandra. Därefter har proteinerna undersöks med hjälp av olika biokemiska analysmetoder. De tre reningarna resulterade i 0.3 mg till 1 mg lösligt RAGE med en renhet på 88 till 96%. Bindningsanalys visade att den biologiska aktiviteten var intakt och att funktionen har bevarats mer eller mindre oförändrad över artgränserna genom evolutionen. Det här utvecklade protokollet för att rena upp RAGE ur vävnad är betydelsefullt för studier av RAGE och dess ligander. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Tuvesson, Jonas LU
supervisor
organization
course
KEMZ03 20161
year
type
H1 - Master's Degree (One Year)
subject
keywords
Purification from tissue, S100A9, Receptor for advanced glycation endproducts, biochemistry, biokemi
language
English
id
8892262
date added to LUP
2016-11-08 08:55:52
date last changed
2016-11-08 08:55:52
@misc{8892262,
  abstract     = {In this study a method for small scale purification of the protein RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) was developed and soluble RAGE was purified from bovine and mice tissue. In healthy animals RAGE is expressed in measurable levels only in lungs and therefore lungs have been used. The tissue was homogenized and thereafter RAGE was purified using Concanavaline A (Con A)-Sepharose, Heparin-Sepharose and ion-exchange chromatography. The purified proteins were identified and characterized by electrophoresis, Western blotting and mass spectrometry. Also one RAGE ligand, S100A9, could be purified, from the flow through from the Con A-Sepharose column. Binding activity and functionality of the proteins were tested using surface plasmon resonance (SPR). Three different RAGE purifications were performed, resulting in 0.3 to 1 mg of soluble RAGE with a purity of 88 to 96%. SPR analysis revealed species-specific binding of antibodies, and binding of the RAGE ligand S100A9 demonstrated a highly conserved functionality. The developed purification protocol constitutes a valuable tool for understanding RAGE and its ligands.},
  author       = {Tuvesson, Jonas},
  keyword      = {Purification from tissue,S100A9,Receptor for advanced glycation endproducts,biochemistry,biokemi},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Purification and Characterization of Soluble Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE)},
  year         = {2016},
}