Impact of antibody-antigen affinity on quantitative analysis of antigen-specific serum IgG by ELISA

Abstract

The aim of this study was to test how the affinity of monoclonal antibodies, raised against a vaccine candidate, influences the results obtained in a quantitative antigen-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The vaccine candidate is a fusion protein consisting of the N-terminal parts of two bacterial cell surface proteins, Rib and Alpha-C. To determine binding protein (Rib or Alpha C) the plates were coated with Rib-N and Alpha C-N separately. The quantity of antibodies was determined in U/ml against a mouse serum standard. By dividing the values obtained for each monoclonal antibody in this antigen specific ELISA with the concentration of IgG for each of the hybridoma supernatants, the specific activity of each monoclonal antibody was determined and expressed as units (U)/µg monoclonal antibody.
Kinetic parameters and affinity constants were then determined for the 5 Rib-N specific and 5 of the Alp-N specific antibodies by surface plasmon resonance (SPR), using a Biacore 3000 instrument. The monoclonal antibodies were captured by an anti-mouse antibody and the vaccine candidate was injected over the captured monoclonal antibody in different concentrations.
The results showed that the same quantity of different monoclonal antibodies gave different results when quantified by the antigen specific ELISA. Furthermore, the results indicate that differences in affinity for the antigen explain the difference observed between the antibodies in the quantitative ELISA analysis. These results also show that studies like this are of importance for the understanding of what is measured in an ELISA.

Popular Abstract (Swedish)

Vid vaccinering aktiveras kroppens immunförsvar mot den sjukdom som man vaccineras mot. Kroppen bildar antikroppar mot antigenet som finns i vaccinet och då skapas ett skydd mot sjukdomen. Antikropparna som bildas binder till olika ställen på antigenet, men varje enskild antikropp binder specifikt till ett ställe. De bildade antikropparna är polyklonala vilket innebär att de kommer från olika B-celler. Med hybridomteknik kan man odla fram antikroppar med samma specifika inbindningsställe. De kallas då monoklonala antikroppar och kommer från samma B-cell.
Innan vaccinet är godkänt att användas på människor görs olika studier. I dessa studier vill man bland annat mäta hur mycket antikroppar som bildas i kroppen vid vaccinering och helst vill man få svaret i en enhet som tillåter jämförelser mellan olika studier eller olika metoder. En sådan enhet kan t.ex. vara gram antikroppar per liter serum (g/L).
För att mäta hur mycket antikroppar som bildas används ofta en metod som på engelska heter enzyme-linked immunosorbent assay, vilket förkortas ELISA. I botten på brunnarna i en microtiterplatta sätter man fast antigenet. Man tillsätter det serum som man vill testa och om det finns specifika antikroppar i serumet kommer dessa att binda till antigenet. De antigen-specifika serumantikropparna kan därmed detekteras och kvantifieras. För att mäta mängden bildade antikroppar i en jämförbar storlek, till exempel g/L, jämförs proverna med en standard med känd koncentration.
Bindningen mellan en antikropp och dess antigen är en reversibel reaktion. Det innebär att bindning mellan antikroppen och antigenet kan bildas för att sedan släppa igen. Efter ett tag har jämvikt uppstått. Då är mängden bundet antigen-antikropp konstant i förhållande till fritt antigen och fri antikropp. Detta förhållande beskrivs av associations konstanten KA. Ju mer komplex som finns vid jämvikt desto större värde på KA. KA varierar mellan olika antikroppar och är ett mått på affiniteten (styrkan i bindningen) mellan en antikropp och dess antigen.
I denna studie har jag undersökt hur ett antal vaccin-specifika monoklonala antikroppars affinitet påverkar resultatet i en kvantitativ ELISA utvecklad för att mäta koncentrationen av vaccin-specifika antikroppar i humant serum. Antikropparna har således kvantifierats i en antigen specifik ELISA d.v.s. en ELISA med antigenet (vaccinet) i botten som beskrivits ovan. Resultaten i Units per ml (U/ml) har beräknats utifrån en standard och därefter dividerats med den faktiska koncentrationen av monoklonala antikroppar i respektive prov. Det sistnämnda värdet har erhållits genom ytterligare en ELISA analys som mäter den totala koncentrationen av IgG antikroppar oberoende av dessas specificitet. Genom att kombinera resultaten från dessa två olika ELISA analyser har jag därmed erhållit ett mått för hur stort utslag ett mikrogram av respektive monoklonal antikropp ger i den antigen-specifika ELISA analysen (specifik aktivitet; utryckt som U/µg monoklonal antikropp). Antikropparnas affinitet för vaccinet har därefter bestämts med hjälp av Biacore analys och plottats mot deras specifika aktivitet i ELISA.
Resultaten visar att de monoklonala antikropparnas specifika aktivitet varierar avsevärt i den vaccin-specifika ELISA analysen. Resultaten indikerar också att denna variation delvis kan förklaras av antikropparnas olika affinitet för vaccinet.

• author: Tuvesson, Jonas
• supervisor: Bengt Johansson Lindbom
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMK03 20162
• year: 2016
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Chemistry
• keywords: Biacore, Monoclonal antibodies, ELISA, Vaccin, biochemistry, biokemi
• language: English
• id: 8895834
• date added to LUP: 2017-01-11 10:07:50
• date last changed: 2017-01-11 10:07:50