Advanced

Crystallization of a Aquaporin Membrane Protein SoPIP2;1 Expressed in Pichia Pastoris

Kranas, Adam LU (2017) KEMP42 20162
Department of Chemistry
Abstract
Studies of aquaporin’s are broad study field in today’s science. In this master project the membrane protein aquaporin SoPIP2;1 has been studied. The aim of the project was to obtain protein crystals with Lipidic Cubic Phase (LCP) crystallization and study their diffraction. If the obtained resolution of the crystals were satisfying the molecular map also would be studied and that would reveal us a desired resolution on the structure. Different mutants and wildtype SoPIP2;1 has been purified in this laboratory work. The mutants studied were S188E and S115E. It was believed in previous studies that mutant S188E would possibly show the open structure of the channel and that was the aim in studies of both those mutants; to study the open... (More)
Studies of aquaporin’s are broad study field in today’s science. In this master project the membrane protein aquaporin SoPIP2;1 has been studied. The aim of the project was to obtain protein crystals with Lipidic Cubic Phase (LCP) crystallization and study their diffraction. If the obtained resolution of the crystals were satisfying the molecular map also would be studied and that would reveal us a desired resolution on the structure. Different mutants and wildtype SoPIP2;1 has been purified in this laboratory work. The mutants studied were S188E and S115E. It was believed in previous studies that mutant S188E would possibly show the open structure of the channel and that was the aim in studies of both those mutants; to study the open structure of the channel. At the end of the project Calcium titration experiments has been made in order to study the calcium binding properties of the wildtype SoPIP2;1 protein. The results from crystal screening for various types of SoPIP2;1 that are presented above showed that the crystal that were studied in the X-ray diffraction were salt crystals. The conclusion drawn from this master work was that LCP needs more optimization for particular types of protein that are studied by that method. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Struktur studier av vatten kanalen SoPIP2;1 från Spinach.

Syfte för studier av denna jon kanal i detta masterprojekt var att studera kristaller från så kallade membranprotein aquaporin SoPIP2;1 och sedan bestämma dess molekylära struktur till en hög upplösning. Detta kan sedan utnyttjas i vidare forskning för just detta proteinet.
Proteinet som studerades kommer från Spinach. Detta protein överproducerades i jästceller av Pichia Pastoris. Fermentering är namn på metoden som används för att överproducera det sökta proteinet i jästceller. Efter fermenterings processen en del av celler lyserades eller bröts upp med hjälp av så kallad Bead Beating metoden. Detta handlar om att celler med det sökta proteinet skakas drastisk i en... (More)
Struktur studier av vatten kanalen SoPIP2;1 från Spinach.

Syfte för studier av denna jon kanal i detta masterprojekt var att studera kristaller från så kallade membranprotein aquaporin SoPIP2;1 och sedan bestämma dess molekylära struktur till en hög upplösning. Detta kan sedan utnyttjas i vidare forskning för just detta proteinet.
Proteinet som studerades kommer från Spinach. Detta protein överproducerades i jästceller av Pichia Pastoris. Fermentering är namn på metoden som används för att överproducera det sökta proteinet i jästceller. Efter fermenterings processen en del av celler lyserades eller bröts upp med hjälp av så kallad Bead Beating metoden. Detta handlar om att celler med det sökta proteinet skakas drastisk i en buffertlösning som så kallade glass beads tillsätts till. Dessa glass beads slår sönder cellerna. När cellerna slåss sönder eller lyseras så använder man en metod att spinna ner det lyserade cellinnehållet. Cellmembraner flyter runt i lösning vid låg centrifugeringshastighet och det som är på botten är cell organeller och allt annat cellinnehåll. Nästa steg i denna framreningen av detta membranprotein var att tvätta bort detta cell membranlösning med UREA samt NaOH lösningar. Denna metoden gjordes i hög hastighets centrifugering och det nämns till ultracentrifugering.
För att sedan få det sökta proteinet i ren form så gjordes två framrenings steg. Dessa heter Jon bytes kromatografi samt gel filtrarings kromatografi. Det första metoden separerar proteiner med hjälp av dess laddnings skillnad och den andra metoden hjälper och separara proteiner med hjälp av dess storlek skillnad.
Det rena proteinet användes sedan till en så kallad Lipidic cubic phase (LCP) krystaliseringsexperiment. Detta experimentet teoretisk skulle ge möjlighet till proteinkristaller. Den metoden baseras på att cellmembranet som saknas när proteinet framrenas på ett sätt återskapas i denna LCP metoden. Detta återskapande görs med hjälp av en typ av lipid molekyl. När kristaller har producerats så studeras dessa med hjälp av så kallade X-ray diffraktion experiment som utförs i en så kallad synchotron. En ny synchotron laboratorie byggdes nyligen i lund och heter Max IV.
Resultatet av detta masterprojekt visade tyvärr att dessa var inga proteinkristaller utan saltkristaller när dessa har testats i en synchotron i Hamburg. I slutet av detta masterarbete Calcium bindning till ovan nämnda proteinet gjordes.
LCP metoden är i utveckligsstadiet och mängder av lösningar som används för denna metoden är mycket små. Felkällor är många i denna metod och kräver till exempel en krystaliserings robot för att sätta upp själva krystaliseringsexperimentet på en specifik platta. Vid brist av tid kunde inte denna metoden studeras utförligt men i framtiden kan LCP vara en metod som kommer hjälpa att producera kristaller för respektive membranprotein; om metoden utvecklas utförligt av forskare. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Kranas, Adam LU
supervisor
organization
course
KEMP42 20162
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
proteinvetenskap, protein science
language
English
id
8903071
date added to LUP
2017-07-05 09:10:59
date last changed
2017-07-05 09:10:59
@misc{8903071,
  abstract     = {Studies of aquaporin’s are broad study field in today’s science. In this master project the membrane protein aquaporin SoPIP2;1 has been studied. The aim of the project was to obtain protein crystals with Lipidic Cubic Phase (LCP) crystallization and study their diffraction. If the obtained resolution of the crystals were satisfying the molecular map also would be studied and that would reveal us a desired resolution on the structure. Different mutants and wildtype SoPIP2;1 has been purified in this laboratory work. The mutants studied were S188E and S115E. It was believed in previous studies that mutant S188E would possibly show the open structure of the channel and that was the aim in studies of both those mutants; to study the open structure of the channel. At the end of the project Calcium titration experiments has been made in order to study the calcium binding properties of the wildtype SoPIP2;1 protein. The results from crystal screening for various types of SoPIP2;1 that are presented above showed that the crystal that were studied in the X-ray diffraction were salt crystals. The conclusion drawn from this master work was that LCP needs more optimization for particular types of protein that are studied by that method.},
  author       = {Kranas, Adam},
  keyword      = {proteinvetenskap,protein science},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Crystallization of a Aquaporin Membrane Protein SoPIP2;1 Expressed in Pichia Pastoris},
  year         = {2017},
}