LYST-intracting protein (LIP5) expression, purification and affinity analysis with Aquaporin 2

Abstract

Aquaporin 2 (AQP2) acts as a water channel in the apical membrane of principal renal cells in the collecting ducts of the kidney. Upregulation is controlled by stimulation of these cells with vasopressin. Downregulation of the presence of AQP2 in the membrane occurs through ubiquitination and then sorting of the protein via the ESCRT-I, -II and –III complexes into the Multivesicular bodies (MVBs). It then interacts with the soluble protein LIP5 and LIP5 facilitated VPS4 ATPase translocates it into inner vesicles of the MVBs. From there it can either be targeted for lysosomal degradation or released as exosomes into the urine. This project was aimed at investigated the binding between AQP2 and LIP5. The first step was to express the LIP5 in e. coli and purifying the protein. Affinity analysis of the binding between the two proteins was then performed with both fluorescence anisotropy and microscale thermophoresis (MST). Binding between the proteins was observed and the obtained results indicate that the N-terminal domain of LIP5 might be most important for the binding to AQP2. It was also suggested by the results from MST that the amino acid residue K71 is particularly important for the binding. Further work should be performed to further study the binding between AQP2 and LIP5.

Popular Abstract (Swedish)

Har du tänkt på att du behöver kissa oftare än vanligt när du har druckit öl? Eller när du druckit te eller kaffe? Detta beror på ett hormon som heter vasopressin och som produceras i hypofysen. Vassopressin är en slags signal till njurarna att återvinna mer vatten från urinen. Koffein och alkohol påverkar hypofysen så att den producerar mindre vasopressin vilket gör så att mer vatten hamnar i urinen och vi måste springa till toaletten stup i kvarten.

Hur kan då vasopressin påverka vattenåterviningen? För själva återvinnandet står ett protein som kallas Aquaporin 2, AQP2, (ja det finns massa olika aquaporiner och de sitter på lite olika ställen i kroppen). I njurarna filtreras ungefär 180 L vatten varje dag för att kroppen ska bli av med ämnen den inte vill ha. För att vi inte ska bli av med allt detta vattnet genom att kissa behöver en hel del av vattnet tas upp igen. Det är det AQP2 gör. Aquaporinerna är kanaler som sitter i cellens membran och bara släpper igenom vissa molekyler, te.x. bara vatten. Membranen är som väggar som vattnet inte kan ta sig genom utan en aquaporin som fungerar som en sluss eller en dörr för vattenmolekylerna så att de kan ta sig till andra sidan. Vasopressin i blodet gör så att njurcellerna sätter in AQP2 i sina membran. För att vi inte ska samla på oss allt för mycket vatten i kroppen och för att vi ska kunna kissa ut avfall och föroreningar, går AQP2 tillbaks in i njurcellen när den gjort sitt jobb i membranet.

Detta kandidatarbete handlar om en tredje molekyl, proteinet LIP5, som binder till AQP2 för att signalera till cellen att AQP2-molekylen är uttjänt och ska brytas ner i lysosomen. Lysosomen är en organell, en del innuti cellen, som tar hand om saker som cellen vill göra sig av med. Detta inkluderar bland annat förbrukade celldelar eller proteiner, som till exempel AQP2. LIP5, som detta arbete handlar mest om är alltså en signal till cellen att AQP2-molekylen den binder till har gjort sitt och inte kan återanvändas fler gånger i membranet. Mer konkret har detta arbete gått ut på att dels producera och rena fram LIP5 och dels att undersöka mer exakt hur LIP5 och AQP2 binder till varandra.

För att kunna studera LIP5 har den producerats genom att man har låtit den uttryckas i Escherichia coli, en typ av bakterie även känd som E. coli. Interaktionen mellan LIP5 och AQP2 undersöktes sedan med två olika metoder. En modell i datorn användes för att bestämma enstaka aminosyror, byggstenarna som proteiner består av, som kunde muteras för att avgöra hur viktiga de är för bindningen. Samma metoder användes på det naturliga proteinet, som man brukar kalla vildtyp, en avkortad variant av det naturliga proteinet och på en mutant som skiljer med en aminosyra.

Experimenten visade att det muterade proteinet hade svagare interaktion med AQP2 än vildtypen. Även det avkortade proteinet band svagare än viltypen men starkare än mutanten. Detta kan betyda att det är den del som fanns i det avkortade proteinet, N-terminaldomänen (ND), som är viktigast för interaktionen med AQP2. Även mutationen som gjordes är i samma domän och att den band svagare kan betyda att just den muterade aminosyran är viktig för att LIP5 ska kunna binda till AQP2.

• author: Olsson, Caroline
• supervisor: Susanna Horsefield
• organization: Department of Chemistry
• course: KEML13 20171
• year: 2017
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Chemistry
• keywords: Affinity analysis, biochemistry, LIP5, AQP2, biokemi
• language: English
• id: 8911971
• date added to LUP: 2017-07-13 11:18:46
• date last changed: 2017-07-13 11:18:46