Enhanced fluidity liquid chromatography and gas chromatography with mass spectrometric detection for analysis of polar metabolites

Abstract

Instrumental analysis in metabolomics has proven to be a challenging topic due to metabolites having a wide spectrum of physiochemical properties and concentrations. The more conventional techniques in metabolomics include gas chromatography and liquid chromatography coupled with mass spectrometric (MS) detection. In most cases these techniques provide methods that are adequate for metabolomic research, however, certain classes of metabolites still impose a challenge. One such class are metabolites that are polar
(here defined as 0 ≥LogP) and to date none of the common techniques have provided a satisfactory method for their analysis. Recently, enhanced-fluidity liquid chromatography (EFLC) that uses high percentages of modifier (>50%) combined with liquified carbon dioxide (CO2) in the mobile phase has been utilized for the analysis of polar compounds.

In this study, we aim at exploring the potential of EFLC with MS detection in metabolomics. We selected a number of polar metabolites for analysis in our EFLC setup and studied the impact on retention when varying pressure, column temperature, flow rate, modifier composition and modifier/CO2 ratio in the mobile phase. The intention was to then develop an EFLC method and compare the results with an established gas chromatography method coupled with MS detection based on linear range, precision, accuracy, limit of quantification and limit of detection.

The established gas chromatography method could detect 44 metabolites in cultured insulinoma cells (INS-1 832/13), which we used as a model of a complex tissue. However, poor precision and accuracy coupled with high limits of quantification makes this method less than ideal for quantitative analysis at the desired concentrations. The EFLC system could detect 15 metabolites from a mixture of standards. Modifier composition (methanol mixed with 10 mM ammonium formate buffered to pH 3.0) and modifier/CO2 ratio in the mobile phase had the most significant impact on retention. A change in modifier composition was also shown to cause a more rapid decrease in retention for early eluting metabolites compared to later eluting metabolites. In addition, analysis of the same 15 metabolites using hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) on the same column revealed a selectivity difference when compared to the EFLC system. Unfortunately, an EFLC method was not developed due to time constrains and a comparison with the gas chromatography method was not possible.

Popular Abstract (Swedish)

Varje dag pågår parallellt ofantligt många kemiska reaktioner i vår kropp vars funktion är att bryta ner och bygga upp olika typer av molekyler. Ett samlingsnamn för de molekyler som både bryts ner och används som byggstenar i kroppen är metaboliter och disciplinen som fokuserar på studien av dessa metaboliter kallas för metabolomik. Metabolomik kan användas för att få en fördjupad förståelse för hur olika typer av dieter, läkemedel och sjukdomar påverkar vår kropp, vilket i sin tur leder till en bättre förståelse för de kemiska processerna som gör vårt vardagsliv möjligt. På sikt kan denna kunskapen tillämpas för att utveckla bättre behandlingar som bidra till ett förbättrat levnadsförhållande för alla.

Metabolomik har många intressanta och spännande frågeställningar som kan ha en betydande inverkan på vår uppfattning om hur en organism fungerar, men att få svar på dessa frågor är ingen enkel uppgift. En av de större utmaningarna inom metabolomik är att hitta rätt instrument som ska användas för att studera de olika metaboliterna. Metaboliter har väldigt olika kemiska egenskaper, vilket är anledningen till att det i nuläget inte finns en metod som kan analysera alla metaboliter samtidigt. Vissa metaboliter har också visat sig vara mer problematiska att analysera än andra. Detta gäller exempelvis för metaboliter som är hydrofila och här finns utrymme för vidare studier. Begreppet ”hydrofil” innebär att en molekyl är löslig i vatten och är en kemisk egenskap som delas av många metaboliter.

Vår forskning har fokuserat på att utveckla en ny metod (s.k. enhanced-fluidity liquid chromatography (EFLC)) för att bestämma koncentrationerna för en viss grupp av hydrofila metaboliter i cellprover och sedan jämföra den med en redan etablerad metod (baserad på gaskromatografi). Genom att utveckla en metod för gaskromatografi kunde vi detektera 45 olika metaboliter, men koncentrationerna för majoriteten av dessa metaboliter var för låga för att göra en koncentrationsbestämning i cellprover. Däremot om metoden skulle appliceras på andra typer av prover där metaboliter förkommer i högre koncentrationer (exempelvis plasma) så förväntas metoden fungera bättre, vilket i sin tur skulle leda till att vi kan bestämma koncentration på fler metaboliter.

EFLC är en metod som använder koldioxid i vätskeform blandat med ett lösningsmedel (exempelvis metanol) för att analysera prover. I våra experiment använde vi en blandning av koldioxid, vatten och metanol vilket ledde till att vi kunde detektera 15 metaboliter. Detta visar på att EFLC kan användas för att analysera hydrofila metaboliter, men det låga antalet detekterade metaboliter jämfört med gaskromatografi medför att EFLC i nuläget inte presterar tillräckligt bra för att ersätta mer etablerade metoder inom metabolomik. Vidare stötte vi på komplikationer med att detektera våra metaboliter som i sin tur ledde till att det inte fanns tid att göra någon koncentrationsbestämmelse i cellprover med EFLC.

Framöver skulle det vara intressant att undersöka om vi kan utöka antalet detekterade hydrofila metaboliter med EFLC samt att göra en koncentrationsbestämmelse i cellprover. Detta skulle undersökas genom att exempelvis byta detektor eller ändra på sammansättningen av lösningsmedlet som blandas med koldioxiden. Om vi lyckas med detta skulle vi kunna göra en rättvis jämförelse med gaskromatografi. Därmed finns det utrymme för vidare forskning kring applikationen av EFLC i metabolomik.

• author: Carrara Aste, Jonathan
• supervisor: Peter Spégel
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMR36 20172
• year: 2018
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Chemistry
• keywords: Enhanced fluid liquid chromatography, gas chromatography, polar metabolites, mass spectrometry, metabolomics, analytical chemistry, analytisk kemi
• language: English
• id: 8936069
• date added to LUP: 2018-03-12 11:34:38
• date last changed: 2018-03-12 11:34:38