Transient Receptor Potential Ankyrin 1, A sequence study and facilitating protein crystallization

Abstract

The Transient Receptor Potential, TRP, family is a group of non-selective ion channels which can be activated by harmful stimuli such as temperature, chemicals and mechanical stimuli. The channels play a crucial role in many physiological processes and it is therefore of great interest to know more about these proteins. The TRPA1 is one of many TRP channels, and a better knowledge of its function could lead to a development of repellents against insects such the pine weevil, a beetle which is causing problems by ring barking trees and thereby making it a challenge to establishing new forest at clearings. The sequence of the TRPA1 gene in pine weevil is not completely established and to expand the known sequence PCR was used to amplify fragments of the gene. By sequencing of PCR products it was possible to confirm parts of the coding sequence and also to verify four intron positions that were previously only predicted. A new strategy to facilitate crystallization of the human TRPA1 protein was tried out. It was hypothesized that removal of putatively unordered parts of the protein, possibly including the N-terminal carrying the His-tag, by a trypsin digestion would make it more stable and easier to crystallize. To be able to localize the TRPA1 lacking the His-tag, a TRPA1 antibody was tested and proved to work. The trypsin digestion proved successful and is recommended in further work aiming at a crystal structure of the human TRPA1 protein.

Popular Abstract (Swedish)

En människa utsätts varje dag för smärta, vilken kan ha orsakats av exempelvis tryck, värme, kyla eller någon sorts kemikalier. Smärtan är nödvändigt för att kroppen ska förstå att den befinner sig i en skadlig situation. Så fort vi utsätts för ett hårt tryck, en extrem temperatur eller farliga kemikalier detekteras detta av speciella receptorer i nervtrådar som skickar vidare signaler till hjärnan där det tolkas som smärta och ger oss möjlighet att undvika den skadliga situationen.

Proteiner är de molekyler som bygger upp och ansvarar för de olika funktionerna i vår kroppar på molekylär nivå. TRP kanalerna är en typ av proteiner som fungerar som smärtreceptorer och är inblandade i många livsnödvändiga processer så som signalering och transport, både under normala förhållanden och i många sjukdomsrelaterade processer. TRPA1, även kallad wasabi-receptorn, är en av många TRP kanaler vilka också har en motsvarighet i insekter. Genom att jämföra TRPA1 från människa med insekternas version kan vi få en bättre förståelse av hur dessa proteiner fungerar. Detta kan även leda till utvecklingen av repellenter mot insekter såsom snytbaggen, en skalbagge som ringbarkar skogsplantor och därför utgör ett problem vid etablering av ny skog efter avverkning. Därför är det mycket viktigt att utveckla förståelsen av dessa proteiner, både vad gäller genen som kodar för proteinet och hur proteinet ser ut i 3D.

En gen är uppbyggt av exoner (huvudsakligen proteinkodande dela) och introner (delar som inte kodar för protein). När ett protein ska tillverkas klipps intronerna bort så bara exonerna blir kvar. Dessa utgör ”receptet” för proteinet och kallas den kodande sekvensen. Hela TRPA1 genen i snytbagge är inte känd, speciellt inte delar rörande intronerna. I ena delen av detta projekt låg fokus på att utöka den kända sekvensen med hjälp av en teknik som kallas PCR (Polymerase Chain Reaction) där man skapar många kopior av en specifik region av DNA:t. Dessa DNA fragment kan senare undersökas och sekvenseras. I mitt arbete kunde jag bekräfta delar av den kodande sekvensen och fick även fram tidigare okänd sekvens från icke kodande regioner (introner). Detta kommer att underlätta framtida undersökningar av de olika genvarianter (alleler) som finns i olika individer av snytbagge.

Om man vill förstå hur ett specifikt protein fungerar är det till stor hjälp om man vet hur den molekylära strukturen ser ut i 3D. Problemet är att proteiner är för små för att studera i vanligt mikroskop. Man får därför ta till andra metoder, där kristallisering är en vanlig metod. Man försöker då få proteinet att bilda kristaller där proteinet sitter i välordnade repetiva enheter med precis en och samma form. Kristallen belyses med Röntgen strålar och utifrån hur dessa sprids kan man räkna ut 3D strukturen av proteinet. För att få ett bra resultat krävs det att proteinet är stabilt och inte antar en massa olika alternativa 3D former. I detta projektet var syftet att skapa en mer stabil form av det humana TRPA1 proteinet genom att klippa av rörliga delar med enzymet trypsin. I detta pilotprojekt kunde vi visa att det fungerar att klippa av delar av proteinet, vilka troligen utgörs av flexibla regioner. I en uppskalad version kan detta nu, efter att trypsin tagits bort, användas för att prova om det går lättare att få välordnade kristaller av TRPA1 och därmed en mer detaljrik bild av dess 3D struktur.

• author: Pehrsson, Erika
• supervisor: Urban Johanson
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMK03 20181
• year: 2018
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Chemistry
• keywords: biochemistry, biokemi
• language: English
• id: 8949696
• date added to LUP: 2018-06-21 14:44:47
• date last changed: 2018-06-21 14:44:47