Cloning, Expression and Purification of the Mitochondrial Pyruvate Carrier

Abstract

More than 400 million people in the world have type 2 diabetes, making it one of
the most common diseases internationally according to the World Health Organization.
Thiazolidinediones (TZDs) is used to treat type 2 diabetes since it increases
the sensitivity of insulin in peripheral tissues. The knowledge about the mechanism
how TZD works is limited which has resulted in patients getting serious side effects
upon receiving treatment. The target of TZD has recently been identified as the
mitochondrial pyruvate carrier complex (MPC) but studies have not yet provided
detailed knowledge about the structure and functional mechanisms of the complex.
By determining the structure and function of the complex, designing a de novo TZD
would be possible. The purpose of this study is to solve the crystal structure of the
MPC 4 from Pinus patula as a candidate of the pyruvate carrier complex family. The
sequence containing the protein was designed and commercially obtained with the
positioning of the poly Histidine-Tag (His-Tag) in the C-terminus. Expression of the
protein was obtained through transformation into the expression host of Escherichia
Coli BL21(DE3) and the yeast host of P. pastoris for comparison and determination of
the best host organism. When sufficient amount of protein was produced an optimized
purification protocol for the proteins was implemented to acquire pure protein
using immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and size exclusion
chromatography (SEC). To keep the protein stable and soluble for further analysis a
suitable detergent was found to be DDM which was used throughout the purification
process. From Western Blot (WB) analysis it was shown that the expression of
the protein was successfull in both bacteria and yeast, however during purification
only low concentration of the protein was obtained. Through Sodium Dodecyl Sulfate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) analysis after the IMAC and
SEC the samples did not seem to be pure. For future studies optimization of both
expression and purification is needed to obtain a higher concentration of the protein
that is pure.

Popular Abstract (Swedish)

Växtprotein - lösningen för bekämpning av typ 2 diabetes?

Mer än 400 miljoner människor i världen lider av diabetes typ 2 vilket gör det till en avde vanligaste folkhälsosjukdommarna enligt World Health Organisation (WHO). Thiazolidinediones (TZDs) används vid behandling av typ 2 diabetes då det höjer känsligheten för insulin. Kunskap om mekanismen kring TZD har tidigare varit begränsad vilket resulterat i att patienter fått allvarliga biverkningar vid behandling. Proteinet som TDZ påverkar blev nyligen identifierat som mitokondrie pyruvat bärar komplexet (MPC). Genom att ta reda på strukturen och funktionen av klomplexet kan utveckling av ett mer specifikt läkemedel utan biverkningar för patienter vara möjlig. Bärarproteiner är nödvändiga för transport av molekyler i biologiska system. MPC är ett membranprotein som är lokaliserat i mitokondriens innermembran. Uppgiften är att transportera pyruvat från cellen in till mitokondrien. Studier har hittills inte kunnat påvisa detaljerad information om strukturen och funktionen hos proteinet. Syftet med denna studie är att påbörja en utredning av MPC komplexet genom att använda MPC 4 från växten Pinus patula. Kloning och uttryck av MPC 4 från Pinus patula i bakterie samt jäst och därefter olika försök till upprening av proteinet kommer att behandlas i denna studie. Följande frågeställningar uppstod: Vilken organism uttrycker proteinet bäst? Vilken metod är optimal för upprening av proteinet? Vilken struktur har proteinet? För att kunna besvara frågorna tillämpades metoderna: kloning, uttryck av proteinet och upprening. Genen stoppades in i en bakterie som kan producera väldigt mycket av proteinet och är ett system som är lätt att jobba med. Sedan sattes produkten in i en bakterie som är bra på att uttrycka ett speciellt protein. Uttryck av proteinet i bakterierna skedde genom att sätta bakterierna innehållande proteinet i en näringsberikad lösning och låta dem växa i 37°C. Därefter tillsattes ett ämne för att aktivera överuttryck av proteinet vilket ger höga koncentrationer av det önskade proteinet. Sedan skördades bakterierna genom centrifugering och bakterierna utan näringslösning sparades för vidare analys. Vid uttryck av proteinet i jäst aktiverades överuttryck genom ett utbyte av näringslösning som jästen växer i. Från att växa i en glycerolberikad miljö till att växa i en miljö där metanol är närvarande. Detta aktiverar en del av jästen som tillåter nedbrytning av metanol vilket resulterar i överproduktion av det önskade proteinet. Två olika sammansättningar av proteinet undersöktes där det ena var anpassat till bakterier och det andra till jäst. Det visade sig att resultatet av proteinet i bakterie och jäst inte hade stora skillnader, kloningen av proteinet i jäst utfördes av Dr. Tamim Al Jubair medan kloning av proteinet i bakterien samt uttrycket hos både bakterien och jästen utfördes av författaren. Uttryck av proteinet lyckades, men dessvärre var det inte rent till den grad som behövs för fortsatt analys. Efter olika uppreningsförsök av proteinet var det fortfarande inte rent. Orsaker till att uppreningen av proteinet inte lyckades kan vara många men förmodligen ligger problemet i konstruktionen vilket lyckligtvis går att ändra på inför fortsatta studier. Vid framtida studier bör därför olika konstruktioner testas för att undvika detta samt få en högre koncentration av proteinet. Funktionen av proteinet bör testas och strukturbestämning genom kristallografi. Om strukturen kan lösas kan forskare förhoppningsvis tillverka en ny TZD medicin utan biverkningar för patienter med typ 2 diabetes

• author: Hamarashid, Helin
• supervisor: Susanna Törnroth-Horsefield
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMT30 20191
• year: 2019
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Chemistry
• keywords: Biochemistry, Diabetes, MPC, TZD, Plant, Yeast, Bacteria, Protein science, Proteinvetenskap
• language: English
• id: 8991307
• date added to LUP: 2019-08-19 13:55:45
• date last changed: 2019-08-19 13:55:45