Crystallization of Fructose Dehydrogenase from Gluconobacter japonicus NBRC3260

Abstract

As the consumption of energy increase in today’s world, the need for new fuel sources is of central importance. In order to be considered viable in the long run, the new energy sources must provide high efficiency and low environmental impact. The search for alternative fuels and energy extraction methods have become increasingly focused on finding ways to mimic systems found within nature. Oxidoreductases are a group of enzymes characterized by electron transfer reactions performed in numerous biological processes. These enzymes have showed great potentially to act as electrode-coupled catalysts in biofuel cells, which allows utilization of many new biofuels at low production costs and minimal environmental impact. But the complex nature of enzymes imposes restrictions for our exploitation of their electrochemical potential. The coupling between enzyme and electrode is one of the main issues for our intended purpose, most oxidoreductases depend on molecules to transfer the electrons from enzyme active site to the electrode, which results in low current- and power densities.

Fructose dehydrogenase (FDH) is a membrane bound heterotrimeric flavoprotein-cytochrome c complex that catalyzes the oxidation of D-fructose into 5-keto-D-fructose through a covalently bond flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor. It is one of few enzymes capable of conducting effective direct electron transfer (DET) from substrate to electrode, thereby it possess advantages such as higher substrate specificity and elimination of voltage losses connected to mediated electron transfer. Although FDH has been extensively studied over the past decades, the full mechanism of the DET mechanism has not been possible to elucidate in absence of the tree-dimensional structure. At present, the structural information is of utmost importance for further development. Structural information enables genetic engineering directed toward specific properties and thereby improve the electrode-coupled enzyme catalysis. Moreover it could open up possibilities to design artificial analogues with desired properties held by FDH.

This project covered the initial work of the protein crystallization procedure. The purity and stability of the initial protein sample was assessed with size exclusion chromatography, followed by SDS-PAGE. The buffer composition was assessed and optimized by Differential scanning fluorimetry (DSF) to provide the protein highest possible stability. Crystals were produced in initial screening, and proved reproduceable in the initial crystallization conditions. Further optimization of these conditions generated larger crystals. None of the obtained crystals diffracted when exposed to x-ray beam.

Popular Abstract (Swedish)

Teknologins snabba utveckling och de omfattande förändringar som det inneburit för människans levnadssätt är både fascinerande och skrämmande. Allt eftersom tekniken utvecklats har vi kommit att bli mer beroende av elektroniska hjälpmedel, vilket ställt det moderna samhället inför utmaningen att finna nya energikällor och långsiktigt hållbara strategier att utvinna dem på. De senaste decennierna har elektronisk utrustning miniatyriserats och i allt större utsträckning övergått till att vara portabel, vilket gjort att en större variation av bränslen behövs för att tillgodose nya nischade användningsområden. Förmågan att tillvarata och omvandla energi är en grundläggande förutsättning för allt liv. Årtusenden av evolution har försett biologiska processer med sofistikerade mekanismer för högeffektiv energiomvandling, där komplexa proteiner som kallas enzymer utgör en avgörande roll genom att påskynda de kemiska reaktionerna. Mekanismerna bakom reaktionerna som sker med hjälp av enzymer studerats noga i hopp om att kunna efterlikna naturens tillvägagångssätt och därigenom lyckas extrahera energi från nya energikällor.

Fruktos dehydrogenas (FDH) är ett enzym som har särskilt tilltalande karaktärsdrag i denna kontext. FDH hör till enzymklassen oxidoreduktaser vars huvudsakliga funktion är att överföra elektroner mellan molekyler, dessa elektronöverföringar motsvarar de reaktioner som utförs av metallkatalysatorer i konventionella bränsleceller. Därför är oxidoreduktaser kapabla att tjäna som biokatalysatorer och driva bränsleceller, vilket innebär att en stor variation av sockerarter och alkoholer kan användas som primär energikälla för att producera elektricitet. Men dessvärre är det svårt att få enzymer att prestera enligt önskan, det beror bland annat på att det är svårt att koppla enzymer direkt till elektroder så att elektroner kan överföras tillräckligt effektivt. FDH hör till ett fåtal enzymer som har förmågan att överföra elektroner till elektroden direkt och därmed prestera med hög elektrokemisk kapacitet vid tillämpning i bränsleceller. Mekanismen som den här typen av direkt elektronöverföring sker genom är av yttersta intresse för att förbättra den elektrokemiska kommunikationen mellan enzymer och elektroder. Trots att FDH har studerats omfattande under många år har den fullständiga mekanismen inte gått att kartlägga utan att känna till den tredimensionella molekylärstrukturen.

Detaljrik strukturbestämning av proteiner kan göras genom en metod som kallas röntgenkristallografi. Principen bakom metoden är att skapa en kristallstruktur, där proteinmolekyler måste vara placerade i ett välordnat mönster, därefter bestrålas den med röntgenstrålar för att ta fram rådata som vidarebearbetas matematiskt och utfaller i atomernas exakta tredimensionella positioner. Detta projekt omfattade det initiala arbetet i kristalliseringsprocessen av FDH. Proteiner är oerhört känsliga och tenderar att falla sönder när de berövas sin biologiska atmosfär, därför var utgjordes de första stegen i projektet av analys, utvärdering och optimering av miljöbetingelser för att stabilisera FDH i högsta möjliga mån. Kristaller erhölls vid det initiala kristalliseringsförsöket och kunde därefter replikeras och optimerades, vilket resulterade i större kristaller. De erhållna kristallerna bestrålades med röntgenstrålar men genererade dessvärre ingen diffraktion.

• author: Filipcev, Ivana
• supervisor: Susanna Törnroth-Horsefield
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMK03 20191
• year: 2019
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Chemistry
• keywords: biochemistry, biokemi, crystallization, fructose dehydrogenase
• language: English
• id: 8991929
• date added to LUP: 2019-09-12 08:48:29
• date last changed: 2019-09-12 08:48:29