Advanced

Intrinsic fluorescence of N-terminal truncated AgTRPA1 mutants

Mattsson, Jonna LU (2020) KEMR30 20201
Department of Chemistry
Abstract
Malaria is a global health issue affecting hundreds of millions of people worldwide and accounts for as much as 405 000 deaths annually. Preventative actions are taken but are seemingly not enough to eradicate the spread. Targeting underlying molecular mechanisms behind the host-seeking behavior of the principal malaria vector Anopheles gambiae, would offer a new approach in the development of an efficient repellant. The host-seeking behavior in A. gambiae is directed by chemosensory neurons as a part of the chemosensory system, where chemosensory receptors such as the transient receptor potential subtype A (TRPA1) are found. TRPA1 is a non-selective cation channel activated by a plethora of stimuli, including temperature and electrophilic... (More)
Malaria is a global health issue affecting hundreds of millions of people worldwide and accounts for as much as 405 000 deaths annually. Preventative actions are taken but are seemingly not enough to eradicate the spread. Targeting underlying molecular mechanisms behind the host-seeking behavior of the principal malaria vector Anopheles gambiae, would offer a new approach in the development of an efficient repellant. The host-seeking behavior in A. gambiae is directed by chemosensory neurons as a part of the chemosensory system, where chemosensory receptors such as the transient receptor potential subtype A (TRPA1) are found. TRPA1 is a non-selective cation channel activated by a plethora of stimuli, including temperature and electrophilic compounds. The development of an efficient repellant would require more elaborate studies on the mosquito TRPA1 protein (AgTRPA1). The crystal structure of AgTRPA1 has heretofore not been resolved and thus other methodological approaches have been employed to gain a better insight in the structural modalities involved in the thermo- and chemosensitivity of the protein. One of these included systematic truncations of the large protein, resulting in a protein lacking the large N-terminal ankyrin repeat domain (ARD) but with retained function in thermo- and chemosensitivity. In this project, the Anopheles gambiae TRPA1 protein lacking the N-terminal has been subjected to site-directed mutagenesis, where two Trp-residues (W779 and W950) believed to be reporting on conformational changes upon electrophilic activation have been mutated to Phe-residues. The mutated proteins were heterogeneously expressed in the yeast Pichia pastoris, purified by Ni-NTA affinity chromatography and characterized by intrinsic fluorescence quenching upon electrophilic activation. It is suggested by the present study that Trp-779 and Trp-950 are neither reporting on conformational changes nor contributing to the total fluorescence intensity of the N-terminal ARD truncated AgTRPA1 protein. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Malaria är en av vår nutids största globala hälsoproblem och skördar hundratusentals människoliv årligen. Malaria är en parasitisk sjukdom, där Plasmodium falciparum är den gängse malariaparasiten. Denna parasit infekterar vanligen den afrikanska malariamyggan, Anopheles gambiae, som i sin tur har en hög preferens för just oss människor. Således sker spridningen av malaria till människor primärt genom denna mygga. Skyddsåtgärder i form av insektsnät och insekticider är vad vi idag har att tillgå för att förhindra spridningen av malaria. Trots vidtagandet av dessa åtgärder ses en uppåtgående trend i antalet inrapporterade malariafall världen över, vilket tyder på att åtgärderna inte räcker till och att nya lösningar därför fordras.

För... (More)
Malaria är en av vår nutids största globala hälsoproblem och skördar hundratusentals människoliv årligen. Malaria är en parasitisk sjukdom, där Plasmodium falciparum är den gängse malariaparasiten. Denna parasit infekterar vanligen den afrikanska malariamyggan, Anopheles gambiae, som i sin tur har en hög preferens för just oss människor. Således sker spridningen av malaria till människor primärt genom denna mygga. Skyddsåtgärder i form av insektsnät och insekticider är vad vi idag har att tillgå för att förhindra spridningen av malaria. Trots vidtagandet av dessa åtgärder ses en uppåtgående trend i antalet inrapporterade malariafall världen över, vilket tyder på att åtgärderna inte räcker till och att nya lösningar därför fordras.

För att överleva är förmågan att kunna orientera sig i omgivande miljöer avgörande för såväl människor som djur. Att detektera och tolka signaler från omgivningen sker genom olika sinnen. Ett sinne är förmågan att uppfatta en eller flera signaler från den kringliggande miljön och att sedan skapa en perception av dessa. Sinnena är kopplade till sinnesorgan, vilka är utrustade med så kallade sinnesceller som innehåller proteinreceptorer. Dessa receptorer reagerar på olika sorters signaler som i sin tur innehåller information om omgivningen. Sådana signaler omvandlas så småningom till elektriska signaler (nervimpulser) som propageras via nervsystemet och slutligen når hjärnan där informationen kan bearbetas och förvandlas till ett intryck.

Likt oss människor har malariamyggan också sinnesorgan som den exempelvis använder för att aktivt hitta föda (människovärdar). Malariamyggan uppsöker sina människovärdar genom att bland annat detektera olika dofter men även värme, vilket resulterar i ett människovärdssökande beteende. Receptorerna som delvis ligger bakom detektionen och förmedlingen av olika signaler är nästan uteslutande proteiner som sitter i cellmembranet. Bland dessa membranproteiner finns Transient Receptor Potential subtype A1-proteinet (TRPA1) som kan reagera på värme och olika kemikalier. Genom att genomföra studier med syftet att förstå detta inneboende beteende hos myggan och dess underliggande molekylära mekanismer, kan förhoppningsvis nya metoder för att minska spridningen av malaria utvecklas.

Denna studie ämnade till att få en övergripande inblick i vilka strukturella element i proteinet TRPA1 som är kopplade till själva aktiveringen av proteinet. För att förstå ett protein och dess funktion studeras vanligtvis strukturen, för vilket en rad olika metoder finns att tillgå. I denna studie användes speciellt den inneboende fluorescensen i proteinet. Den inneboende fluorescensen härstammar från aminosyran tryptofan som kan avge ljus – den fluorescerar. Tryptofan kan avge mycket eller lite ljus beroende på vilken miljö den är placerad i, något man kan utnyttja för att se om proteinet ändrar struktur när det aktiveras. I denna studie studerades två utvalda tryptofaner som båda förmodas fungera som ett slags rapportörer av strukturella förändringar i proteinet. För att studera dessa tryptofaners roll i eventuella konformationsändringar i proteinet, muterades dessa till aminosyran fenylalanin som inte kan fluorescera i den mätmetod som användes.

Resultaten från fluorescensmätningarna av de muterade proteinerna visade ingen skillnad jämfört med det ursprungliga proteinet i den uppmätta fluorescensen. Studien konkluderar att de två utvalda tryptofanerna förmodligen inte har någon större roll i konformationsändringar av proteinet vid aktivering. Mer omfattande studier krävs för att få en ökad förståelse av de strukturella elementen involverade i aktiveringen av proteinet TRPA1. En ökad förståelse kan förhoppningsvis leda till utvecklingen av nya insekticider som sätter stopp för malaria för gott. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Mattsson, Jonna LU
supervisor
organization
course
KEMR30 20201
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
Biochemistry, Biokemi
language
English
id
9024839
date added to LUP
2020-09-16 13:18:23
date last changed
2020-09-16 13:18:23
@misc{9024839,
  abstract     = {Malaria is a global health issue affecting hundreds of millions of people worldwide and accounts for as much as 405 000 deaths annually. Preventative actions are taken but are seemingly not enough to eradicate the spread. Targeting underlying molecular mechanisms behind the host-seeking behavior of the principal malaria vector Anopheles gambiae, would offer a new approach in the development of an efficient repellant. The host-seeking behavior in A. gambiae is directed by chemosensory neurons as a part of the chemosensory system, where chemosensory receptors such as the transient receptor potential subtype A (TRPA1) are found. TRPA1 is a non-selective cation channel activated by a plethora of stimuli, including temperature and electrophilic compounds. The development of an efficient repellant would require more elaborate studies on the mosquito TRPA1 protein (AgTRPA1). The crystal structure of AgTRPA1 has heretofore not been resolved and thus other methodological approaches have been employed to gain a better insight in the structural modalities involved in the thermo- and chemosensitivity of the protein. One of these included systematic truncations of the large protein, resulting in a protein lacking the large N-terminal ankyrin repeat domain (ARD) but with retained function in thermo- and chemosensitivity. In this project, the Anopheles gambiae TRPA1 protein lacking the N-terminal has been subjected to site-directed mutagenesis, where two Trp-residues (W779 and W950) believed to be reporting on conformational changes upon electrophilic activation have been mutated to Phe-residues. The mutated proteins were heterogeneously expressed in the yeast Pichia pastoris, purified by Ni-NTA affinity chromatography and characterized by intrinsic fluorescence quenching upon electrophilic activation. It is suggested by the present study that Trp-779 and Trp-950 are neither reporting on conformational changes nor contributing to the total fluorescence intensity of the N-terminal ARD truncated AgTRPA1 protein.},
  author       = {Mattsson, Jonna},
  keyword      = {Biochemistry,Biokemi},
  language     = {eng},
  note         = {Student Paper},
  title        = {Intrinsic fluorescence of N-terminal truncated AgTRPA1 mutants},
  year         = {2020},
}