The anti-amyloidogenic activity of the chaperone DNAJB6 and mimic constructs with only its serine and threonine-rich β-sheet region
(2021) KEML10 20211Department of Chemistry
- Abstract
- The molecular chaperone DNAJB6 has conserved serine (S) and threonine (T) residues, which are crucial for its ability to efficiently suppress amyloid formation of aggregation-prone amyloidogenic peptides. Substitution of the conserved ST-residues with alanine residues results in loss of this function. These functionally important conserved ST-residues are located in a C-terminal domain, which is composed of β-strands. Amyloid-β-42 (Aβ42) is an example of a peptide that easily forms aggregates, and such aggregates are found in the brain of patients with Alzheimer’s disease. The aim of this project was to investigate the importance of the motif with conserved ST-residues of DNAJB6 for possible anti-amyloidogenic effect using purified DNAJB6... (More)
- The molecular chaperone DNAJB6 has conserved serine (S) and threonine (T) residues, which are crucial for its ability to efficiently suppress amyloid formation of aggregation-prone amyloidogenic peptides. Substitution of the conserved ST-residues with alanine residues results in loss of this function. These functionally important conserved ST-residues are located in a C-terminal domain, which is composed of β-strands. Amyloid-β-42 (Aβ42) is an example of a peptide that easily forms aggregates, and such aggregates are found in the brain of patients with Alzheimer’s disease. The aim of this project was to investigate the importance of the motif with conserved ST-residues of DNAJB6 for possible anti-amyloidogenic effect using purified DNAJB6 mimic constructs containing a minor part of the DNAJB6 protein, particularly the conserved ST-residues that are located in a β-sheet motif in the C-terminal domain of DNAJB6. The anti-amyloidogenic effect was evaluated using a Thioflavin T (ThT) fluorescence assay, where amyloid formation is detected as the fluorescence increase. We used one construct with a 5 kDa β-sheet grafted to calbindin for possible stabilization yielding a 14 kDa construct. A variant construct without such grafting was also used, where instead the most of C-terminal part of DNAJB6 was included for assumed stabilization yielding a 6.3 kDa construct. The results showed that both the 14 kDa construct and the 6.3 kDa construct displayed a small anti-amyloidogenic effect on Aβ42, but required much higher concentrations than DNAJB6 itself. To assure that the observed effect was not unspecific, constructs with alanine substitution of the conserved ST-residues were purified and used in the ThT fluorescence assays. We conclude that both constructs show an anti-amyloidogenic effect that has dependency on the ST-residues, but the low activity compared to DNAJB6 itself could perhaps be due to the differences of how they interact with Aβ42-monomers, -oligomers or -fibrils. (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- Alzheimers sjukdom är en av de vanligaste neurodegenerativa sjukdomarna som leder till demens. Symptom av sjukdomen är bland annat minnesförlust och en försämrad kognitiv förmåga, vilket orsakas av att nervcellerna i hjärnan dör på grund av aggregering av olika peptider. En av dessa peptider, som aggregerar genom att först bilda toxiska oligomerer och sedan amyloida fibriller, är amyloid-β (Aβ). Peptiden Aβ42 innehåller 42 aminosyror och har detekterats i aggregat i hjärnan hos patienter med Alzheimer sjukdom.
Tidigare studier har visat att ett protein vid namn DNAJB6, som finns naturligt i människans alla celler och som innehåller en konserverad och betydelsefull region med aminosyrorna serin (S) och treonin (T), effektivt motverkar... (More) - Alzheimers sjukdom är en av de vanligaste neurodegenerativa sjukdomarna som leder till demens. Symptom av sjukdomen är bland annat minnesförlust och en försämrad kognitiv förmåga, vilket orsakas av att nervcellerna i hjärnan dör på grund av aggregering av olika peptider. En av dessa peptider, som aggregerar genom att först bilda toxiska oligomerer och sedan amyloida fibriller, är amyloid-β (Aβ). Peptiden Aβ42 innehåller 42 aminosyror och har detekterats i aggregat i hjärnan hos patienter med Alzheimer sjukdom.
Tidigare studier har visat att ett protein vid namn DNAJB6, som finns naturligt i människans alla celler och som innehåller en konserverad och betydelsefull region med aminosyrorna serin (S) och treonin (T), effektivt motverkar aggregering genom att troligtvis binda till oligomerer av Aβ42. Syftet med detta projekt är att undersöka den konserverade ST-regionen genom att ta reda på om skapade konstrukt, med endast delar av DNAJB6 som innehåller de konserverade ST-aminosyrorna, har en liknande anti-amyloidogen effekt. DNAJB6 består av tre domäner, där den C-terminala domänen består av ett så kallat β-flak med fyra β-strängar, där de första två β-strängarna innehåller den konserverade ST-regionen och de sista 10 aminosyrorna bildar en α-helix. En hypotes är att denna konserverade ST-region kan interagera med oligomerer av Aβ-peptider genom vätebindningar och på så vis förhindra fortsatt aggregering. Studier har gjorts där dessa ST-aminosyror i DNAJB6 har bytts ut mot aminosyran alanin, och där effekten att förhindra aggregering av Aβ-peptiden nästan upphört helt. Detta visar ST-regionens viktiga betydelse för DNAJB6 och för dess egenskaper att förhindra aggregering.
I detta projekt har vi studerat något vi kallar konstrukt, alltså små tillverkade proteiner som endast innehåller delar av den C-terminala domänen i DNAJB6 och som har konstruerats med molekylärgenetisk teknik. Det första konstruktet består av fyra antiparallella β-strängar som formar ett β-flak. Eftersom konstruktet är litet har det sammanfogats med ett annat protein som heter calbindin. Calbindin är som ett slags skaft som antas öka konstruktets stabilitet. Det andra konstruktet innehåller samma β-flak med de konserverade ST-aminosyrorna och istället för skaft-proteinet innehåller den ytterligare 10 aminosyror från DNAJB6, som antas bilda en α-helix som kan stabilisera konstruktet. För att se om den möjliga aktiviteten av konstrukten beror på den konserverade ST-regionen, har också alanin-substituerade kontroller till konstrukten tillverkats.
Vid undersökningen av hur DNAJB6 och konstrukten kan förhindra aggregering av peptiden Aβ42 användes metoden ThT-fluorescensanalys. ThT är en förkortning av molekylen Thioflavin T vars fluorescens ökar när den binder till amyloida fibriller som bildas över tid. Det som jämfördes var hur snabbt fibriller bildades beroende på om DNAJB6 eller respektive konstrukt var närvarande. Resultaten visade att båda konstrukten kunde förhindra aggregering av Aβ42 till en viss grad i jämförelse med deras alanin-substituerade kontroller. Däremot krävdes en mycket högre koncentration av konstrukten jämfört med den koncentration som krävdes av DNAJB6 för att få en tydlig effekt.
Sammanfattningsvis drog vi slutsatsen att även om ST-regionen är viktig för förmågan hos DNAJB6 att förhindra aggregering, så är inte ST-regionen i sig tillräcklig för full funktion. Vad det beror på är svårt att säga. Nästa steg skulle möjligtvis vara att utvärdera om ST-regionen i konstrukten överhuvudtaget har kvar förmågan att binda Aβ42, även om de som vi sett här inte är lika effektiva som DNAJB6 i att stoppa aggregering och bildning av fibriller. Fortsatta studier behövs för att förstå varför DNAJB6 är effektivt i att stoppa bildning av amyloida Aβ42-fibriller och möjligen utnyttja kroppens egen förmåga genom DNAJB6 att förhindra Alzheimers sjukdom och andra neurodegenerativa sjukdomar. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9049456
- author
- Matus, Vanessa LU
- supervisor
- organization
- course
- KEML10 20211
- year
- 2021
- type
- M2 - Bachelor Degree
- subject
- keywords
- Biochemistry, DNAJB6, Amyloid-β, mimic constructs
- language
- English
- id
- 9049456
- date added to LUP
- 2021-06-16 10:29:30
- date last changed
- 2021-06-16 10:29:30
@misc{9049456,
abstract = {{The molecular chaperone DNAJB6 has conserved serine (S) and threonine (T) residues, which are crucial for its ability to efficiently suppress amyloid formation of aggregation-prone amyloidogenic peptides. Substitution of the conserved ST-residues with alanine residues results in loss of this function. These functionally important conserved ST-residues are located in a C-terminal domain, which is composed of β-strands. Amyloid-β-42 (Aβ42) is an example of a peptide that easily forms aggregates, and such aggregates are found in the brain of patients with Alzheimer’s disease. The aim of this project was to investigate the importance of the motif with conserved ST-residues of DNAJB6 for possible anti-amyloidogenic effect using purified DNAJB6 mimic constructs containing a minor part of the DNAJB6 protein, particularly the conserved ST-residues that are located in a β-sheet motif in the C-terminal domain of DNAJB6. The anti-amyloidogenic effect was evaluated using a Thioflavin T (ThT) fluorescence assay, where amyloid formation is detected as the fluorescence increase. We used one construct with a 5 kDa β-sheet grafted to calbindin for possible stabilization yielding a 14 kDa construct. A variant construct without such grafting was also used, where instead the most of C-terminal part of DNAJB6 was included for assumed stabilization yielding a 6.3 kDa construct. The results showed that both the 14 kDa construct and the 6.3 kDa construct displayed a small anti-amyloidogenic effect on Aβ42, but required much higher concentrations than DNAJB6 itself. To assure that the observed effect was not unspecific, constructs with alanine substitution of the conserved ST-residues were purified and used in the ThT fluorescence assays. We conclude that both constructs show an anti-amyloidogenic effect that has dependency on the ST-residues, but the low activity compared to DNAJB6 itself could perhaps be due to the differences of how they interact with Aβ42-monomers, -oligomers or -fibrils.}},
author = {{Matus, Vanessa}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{The anti-amyloidogenic activity of the chaperone DNAJB6 and mimic constructs with only its serine and threonine-rich β-sheet region}},
year = {{2021}},
}