Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Assessing the viability of probiotic preparations with flow cytometry. A comparison of different methods

Tomasson, My LU (2021) KMBM05 20211
Applied Microbiology
Abstract
This master thesis work was performed in collaboration with BioGaia AB, a Swedish biotech- company producing probiotic supplements containing the bacteria Limosilactobacillus reuteri. The products provided by BioGaia contain live microorganisms. Therefore, a method suitable for the correct enumeration of living cells is crucial in probiotic samples and today the so-called plate count method is used for that purpose.
In this thesis work, flow cytometry (FC) is evaluated as an alternative to the plate count method. Different staining dyes (cFDA/PI, cFDA-SE/PI and cFDA/TOTO-1) were tested for the distinction between live, damaged and dead cells. In these assays, cells with active enzymes are considered live and those with compromised... (More)
This master thesis work was performed in collaboration with BioGaia AB, a Swedish biotech- company producing probiotic supplements containing the bacteria Limosilactobacillus reuteri. The products provided by BioGaia contain live microorganisms. Therefore, a method suitable for the correct enumeration of living cells is crucial in probiotic samples and today the so-called plate count method is used for that purpose.
In this thesis work, flow cytometry (FC) is evaluated as an alternative to the plate count method. Different staining dyes (cFDA/PI, cFDA-SE/PI and cFDA/TOTO-1) were tested for the distinction between live, damaged and dead cells. In these assays, cells with active enzymes are considered live and those with compromised membranes are considered dead. Optimization of assays was performed. Later on, the optimized methods were used to assess the number of living cells in both stressed and unstressed culture samples. Stressors applied were bile salts, heat and humidity. The outcome of the FC analysis was compared to plate count.
The flow cytometry results showed good correlation to plate count for non-stressed samples. For cells subjected to stressors similar results for the different flow cytometry assays were obtained. Agreement with the plate count method varied depended on the type of stress applied. When applying bile salt stress, the correlation was still good, with a better correlation for those cells that have not gone through freeze-drying. For samples exposed to heat and humidity the agreement was poor. The conclusion was that bile salts act on membrane integrity whereas the other two stressors impact cells in ways not comprising the cell membrane integrity. Since all the staining dyes investigated depended in some way on membrane integrity, an assay targeting other cell properties could therefore be of interest and possibly provide a better comparison to plate count. If it’s possible to get closer correlation to plate count for stressed samples, flow cytometry would make an excellent choice of analytical method since its rapid, low in labor and delivers huge amount of valuable data. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Ändrade levnadsvanor i västerländska länder har lett till en ökning av sjukdomar så som IBS, infektioner i mag- och tarmkanal och allergier. Det har dessutom observerats att mikrofloran förändrats och goda bakterier så som Limosilactobacillus reuteri försvunnit. Mag- och tarmkanalen har därmed förlorat sina goda soldater mot patogena fiender med dysfunktionell balans som resultat. Därför är det inte svårt att förstå att populariteten kring probiotiska kosttillskott ökar. BioGaia AB har i över 200 kliniska studier forskat kring L.reuteri för att bidra med bättre folkhälsa.
Världshälsoorganisationens definition av probiotiska bakterier är “levande mikroorganismer som, när de intas i lämplig mängd, utövar hälsofördelar hos värden.”. Med den... (More)
Ändrade levnadsvanor i västerländska länder har lett till en ökning av sjukdomar så som IBS, infektioner i mag- och tarmkanal och allergier. Det har dessutom observerats att mikrofloran förändrats och goda bakterier så som Limosilactobacillus reuteri försvunnit. Mag- och tarmkanalen har därmed förlorat sina goda soldater mot patogena fiender med dysfunktionell balans som resultat. Därför är det inte svårt att förstå att populariteten kring probiotiska kosttillskott ökar. BioGaia AB har i över 200 kliniska studier forskat kring L.reuteri för att bidra med bättre folkhälsa.
Världshälsoorganisationens definition av probiotiska bakterier är “levande mikroorganismer som, när de intas i lämplig mängd, utövar hälsofördelar hos värden.”. Med den meningen i åtanke, visar det på betydelsen av att kunna säkerställa levande bakterier i probiotiska produkter samt i en bestämd mängd, vid en viss tidpunkt och miljö. Detta är en utmanande och viktig uppgift, vilket är anledningen till detta projekt, att försöka hitta en analysmetod som kan hjälpa att göra en så riktig och informativ analys av probiotiska formuleringar som möjligt och kanske dessutom förutsägande för cellers fysiologiska status.
I detta projekt har flödescytometrisk analys utförts med fem olika typer av infärgningskemikalier samt jämförts med plattmetod. Cytometern kan mäta antalet totala celler i provet med indelning i levande, skadade och döda. Plattmetoden däremot, kan endast visa de celler kapabla för reproduktion och bildandet utav kolonier och har inte möjligheten att på olika sätt visa cellernas fysiologiska status. Flera olika typer och behandlingar utav stammar med L.reuteri har använts för jämförelse. Syftet var att vidare undersöka fenomenet tidigare observerat, att stressade celler ger sämre överenskommelse mellan flödescytometrisk analys och plattmetod. Information kring infärgningskemikalierna samt användningsområden undersöktes i en litteraturstudie för att sedan optimera dessa med avseende på koncentration och inkuberingstid. Detta för att i sin tur kunna undersöka vilka applikationer färgerna kan användas till genom att stressa probiotiska celler och undersöka om resultatet är nära plattmetoden. De applicerade stressfaktorerna var syntetisk galla, värme samt fukt.
I en del av experimenten kunde två levande populationer observeras, där förhoppningen var att uppdelningen bestod utav bakterier i bättre eller sämre skick och därmed utgöra en förutsägande bild. Förklaringen till dessa populationer kunde inte hittas i detta projekt men kan vara intressant att undersöka ytterligare. Överraskande nog var skillnaden mellan de olika infärgningarna inte stora när resultaten jämfördes med platta, vilket kan förklaras av mekanismerna av hur de fungerar, genom cellmembranets integritet. För prover som inte stressats fungerade flödescytometern som ett bra alternativ som analysmetod istället för plattmetoden. Däremot visade stressade prover varierande resultat där galla, som påverkar membranet, gav bra överenstämmelse medan värme och fuktstress gav sämre korrelation. I framtiden skulle man därför kunnat använda andra metoder för flödescytometriska metoder
II
som inte enbart tittar på membranet så som reproduktion eller pumpsystemen för att kunna jämföras med platta.
Flödescytometri är en lovande analytisk metod med många vägar att gå för att fördjupa kunskapen kring mikroorganismer, hur de påverkas av olika stress och säkerställa att rätt mängd levande bakterier intas vid en viss tidpunkt. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Tomasson, My LU
supervisor
organization
course
KMBM05 20211
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
Flow cytometry, Probiotics, Fluorochromes, L.reuteri, Applied microbiology
language
English
id
9054282
date added to LUP
2021-06-16 10:28:40
date last changed
2021-06-16 10:28:40
@misc{9054282,
  abstract     = {{This master thesis work was performed in collaboration with BioGaia AB, a Swedish biotech- company producing probiotic supplements containing the bacteria Limosilactobacillus reuteri. The products provided by BioGaia contain live microorganisms. Therefore, a method suitable for the correct enumeration of living cells is crucial in probiotic samples and today the so-called plate count method is used for that purpose.
In this thesis work, flow cytometry (FC) is evaluated as an alternative to the plate count method. Different staining dyes (cFDA/PI, cFDA-SE/PI and cFDA/TOTO-1) were tested for the distinction between live, damaged and dead cells. In these assays, cells with active enzymes are considered live and those with compromised membranes are considered dead. Optimization of assays was performed. Later on, the optimized methods were used to assess the number of living cells in both stressed and unstressed culture samples. Stressors applied were bile salts, heat and humidity. The outcome of the FC analysis was compared to plate count.
The flow cytometry results showed good correlation to plate count for non-stressed samples. For cells subjected to stressors similar results for the different flow cytometry assays were obtained. Agreement with the plate count method varied depended on the type of stress applied. When applying bile salt stress, the correlation was still good, with a better correlation for those cells that have not gone through freeze-drying. For samples exposed to heat and humidity the agreement was poor. The conclusion was that bile salts act on membrane integrity whereas the other two stressors impact cells in ways not comprising the cell membrane integrity. Since all the staining dyes investigated depended in some way on membrane integrity, an assay targeting other cell properties could therefore be of interest and possibly provide a better comparison to plate count. If it’s possible to get closer correlation to plate count for stressed samples, flow cytometry would make an excellent choice of analytical method since its rapid, low in labor and delivers huge amount of valuable data.}},
  author       = {{Tomasson, My}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{Assessing the viability of probiotic preparations with flow cytometry. A comparison of different methods}},
  year         = {{2021}},
}