Purification Methods for Solid-State NMR Analysis of Influenza A M2[18-60]

Abstract

With viral infections becoming an ever-increasing health problem in the world, the study of viral proteins is a cornerstone for understanding and preventing future pandemics. The following work shows the purification and structural characterization of the Influenza A M2 proton channel through solid-state NMR (ssNMR). Despite previously published structures of the M2 proton channel, the method of purification has not been well detailed and requires further optimization in order to produce samples to study at Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP). A truncated version of M2 containing residues 18-60 was studied in this work, which is referred to as M2[18-60]. Purification of labeled and unlabeled M2[18-60] expressed at 22°C and 30°C degrees were performed with varied results. It was found that the expression of M2[18-60] produced the highest yield when expressed in M9 minimal media and that the temperature during expression has no significant impact on the purification results. In addition, there was no difference in purification yield of M2[18-60] using a C3 or C4 column. Both labeled and unlabeled M2[18-60] was able to be reconstituted into liposomes. The acquired 2D 13C-13C correlation spectrum confirmed that presence of M2[18- 60] generated by the previous purification steps. The stability of the M2 protein was confirmed through overlay of previously published assigned spectra of a M2 S31N mutant. Further optimizations of the methods used in this work will be important in order to produce samples of M2[18-60] for future investigations into the design of antiviral drug candidates, ssNMR analysis of binding sites of M2-targeting drugs and assay development.

Popular Abstract (Swedish)

Virusinfektioner har utan tvekan blivit det största hälsoproblemet i världen. I skrivande stund når antalet COVID-19 infektioner i världen upp emot 151 800 000 vilket gör att behovet av vacciner och antivirala läkemedel är viktigare nu än någonsin tidigare. Influensa A är ytligare ett virus som orsakar överdödlighet, trotts att många klarar sig lindrigt vid infektion. För att kunna förhindra eller bromsa influensainfektioner kan antivirala läkemedel användas innan ett vaccin har hunnit producerats. Startpunkten för utvecklingen av antivirala läkemedel är oftast strukturbestämning av virusets proteiner, vilket detta examensarbete lägger grund till.

Antivirala läkemedel kan förhindra eller bromsa influensainfektioner genom att inhibera funktionerna av virusets proteiner. Det finns många proteiner som virus producerar som är viktiga för virusets förmåga att infektera celler och replikera sig. Ett av dessa proteiner heter Matrix 2 (M2). Detta lilla protein består av fyra identiska komponenter, varav varje komponent består av 97 aminosyror. M2 har som funktion att både frisätta virusgenomet, och se till att virusets hemaglutininer behåller sin struktur under viral replikation. Tidigare har det antivirala läkemedlet amantadine använts för att behandla influensainfektioner, men på grund utav mutationer av aminosyrorna i M2 proteinet blev influensa A virus resistenta mot amantadine.

Trotts att M2 har kunnat mutera och bli resistent mot amantadine finns det ännu hopp om att hitta nya antivirala läkemedel som inhiberar M2. För att kunna upptäcka nya läkemedel måste strukturen på M2 bestämmas, vilket kan göras med fast-fas NMR. Denna teknik bygger på visualisering av atomer vars atomkärna är NMR-aktiva. Dessa atomer är tillexempel 1H, 13C och 15N. Genom att stråla ett prov av NMR-aktiva atomer med radiofrekvent strålning kan man se hur olika atomer inom proteinet interagerar med varandra. Detta kan ge insikt i vilka atomer som ligger nära varandra och därmed kan strukturen på proteinet bestämmas.

För att kunna analysera M2 med hjälp av fast-fas NMR måste M2 uttryckas, separeras och urskiljas. I detta examensarbete uttrycktes M2 i E. coli, som agerar som proteinfabrik. M2 uttrycktes i två olika medier samt vid 22°C och 30°C. För att sedan kunna separera och urskilja M2 från andra proteiner användes olika separations och klyvnings metoder. Två olika kolumner användes för att separera proteiner beroende på deras hydrofobicitet, och till slut kunde proteiner urskiljas beroende på deras storlek. Det visade sig att separationen och urskiljningen av M2 var mycket svår då tidigare publikationer inte publicerat deras metodik i detalj. Optimeringar av metoderna gjordes för att till slut kunna producera ett protein som kunde analyseras i fast-fas NMR. Resultatet av fast-fas NMR visade att M2 kunde uttryckas, separeras och urskiljas men att separationsmetoderna behövde optimeras ytterligare.

Resultaten och optimeringarna som publiceras i detta examensarbete lägger grunden för framtida analyser av M2. Förhoppningen är att kunna använda metoderna kring separation och urskiljning av M2 för att utöka kunskapen av strukturen av M2 och på så sätt upptäcka nya antivirala läkemedel.

• author: Gripberg, Maxine
• supervisor: Daniel Topgaard
• organization: Biophysical Chemistry
• course: KFKM05 20211
• year: 2021
• type: H3 - Professional qualifications (4 Years - )
• subject: Biology and Life Sciences; Technology and Engineering; Chemistry
• keywords: Solid-state NMR, Influenza A, M2 proton channel, Biophysical chemistry
• language: English
• id: 9059038
• date added to LUP: 2021-07-01 15:32:26
• date last changed: 2021-07-05 09:31:21