Reconstitution of Hylobius abietis TRPA1 in MSP2N2 nanodiscs
(2022) KEMR45 20212Department of Chemistry
- Abstract
- Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) is a nonspecific cation channel activated by a wide range of stimuli. The polymodal receptor resides in the cell membrane of sensory neurons and plays a key role in nociceptive pain transmission. Environmental irritants such as allyl isothiocyanate, an electrophile found in wasabi, activate TRPA1. In this work, the goal was to lay the basis for structure, and so function and mechanism, studies of Hylobius abietis TRPA1 (HaTRPA1). The large pine weevil, H. abietis, feeds on the bark of conifer seedlings in European plantations, opposing the re-establishment of forests. A natural repellent could be developed targeting HaTRPA1, i.e., by developing agonists of solely HaTRPA1.
Membrane proteins... (More) - Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) is a nonspecific cation channel activated by a wide range of stimuli. The polymodal receptor resides in the cell membrane of sensory neurons and plays a key role in nociceptive pain transmission. Environmental irritants such as allyl isothiocyanate, an electrophile found in wasabi, activate TRPA1. In this work, the goal was to lay the basis for structure, and so function and mechanism, studies of Hylobius abietis TRPA1 (HaTRPA1). The large pine weevil, H. abietis, feeds on the bark of conifer seedlings in European plantations, opposing the re-establishment of forests. A natural repellent could be developed targeting HaTRPA1, i.e., by developing agonists of solely HaTRPA1.
Membrane proteins can be solubilized in aqueous solution by reconstitution in nanodiscs. A nanodisc is a construct of a membrane scaffold protein (MSP) and lipids, which encircles the protein of interest. In this study, MSP2N2 and phospholipids (POPC, POPE and POPG) were used. The reconstitution of HaTRPA1 in MSP2N2 nanodiscs was studied by size exclusion chromatography. The chromatogram showed a separation of two peaks, possibly of empty nanodiscs and nanodiscs containing HaTRPA1. The sample of HaTRPA1 in MSP2N2 nanodiscs was studied by negative stain and single particle cryogenic electron microscopy. The imaging, and dynamic light scattering, of HaTRPA1 in MSP2N2 nanodiscs suggested particles with a size of approximately 25 nm. A truncated form of HaTRPA1 was studied, which lacked most of its peripheral part. Therefore, no clear protrusion from the disc was visible by imaging, and the presence of HaTRPA1 in nanodiscs could not be confirmed further. The amount of purified HaTRPA1 was insufficient, and thus the repeatability of the reconstitution experiment was not ensured. The expression of HaTRPA1 should be improved prior to advancements of structure studies. (Less) - Popular Abstract (Swedish)
- En människa gråter av nyhackad lök, hostar av rök och känner en brännande känsla i munnen av att äta wasabi. Det som ligger till grund för detta är Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1), en receptor i cellmembranet av nervceller. Ett stort antal irriterande ämnen, som allylisotiocyanat i wasabi, aktiverar TRPA1. I sin aktiva konformation, sänder TRPA1 ut en signal som omvandlas av nervsystemet till en känsla av smärta. Därigenom upptäcks skadliga eller potentiellt skadliga stimuli. En bredare förståelse av receptorns funktion och reglering är av intresse. Inom läkemedelsindustrin, till exempel, ses inaktivering av TRPA1 som en möjlig strategi för smärtbehandling. En substans som inaktiverar receptorn, en antagonist, kan utvecklas... (More)
- En människa gråter av nyhackad lök, hostar av rök och känner en brännande känsla i munnen av att äta wasabi. Det som ligger till grund för detta är Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1), en receptor i cellmembranet av nervceller. Ett stort antal irriterande ämnen, som allylisotiocyanat i wasabi, aktiverar TRPA1. I sin aktiva konformation, sänder TRPA1 ut en signal som omvandlas av nervsystemet till en känsla av smärta. Därigenom upptäcks skadliga eller potentiellt skadliga stimuli. En bredare förståelse av receptorns funktion och reglering är av intresse. Inom läkemedelsindustrin, till exempel, ses inaktivering av TRPA1 som en möjlig strategi för smärtbehandling. En substans som inaktiverar receptorn, en antagonist, kan utvecklas som läkemedel. För att lyckas med det, behöver strukturen av TRPA1 klarläggas.
Snytbaggen, Hylobius abietis, är ett hot för nyplanterade barrskogar i Europa. Snytbaggen livnär sig på barrträdens bark, vilket leder till ringbarkning och en påföljande dödlighet hos barrträdsplantor. För att motverka skada på nyplanterade skogar, används i dagsläget insekticider och vax. Insekticider är allmänt kända för att innehålla giftiga ämnen som är skadliga för både människa och miljö. Ett naturligt alternativ på bekämpning kan vara en aktivering av HaTRPA1. I detta projekt var syftet att lägga grunden för strukturella studier av HaTRPA1.
Inför strukturella studier av ett membranprotein, behöver proteinet vara stabilt i lösning. För att uppnå stabilitet kan proteinet sättas i en nanodisk. Detta är en konstruktion av membrane scaffold protein (MSP) och lipider, som efterliknar det naturliga cellmembranet. I varje nanodisk ligger scaffoldproteinet som ett bälte utefter kanten av en rund skiva som utgörs av ett dubbelt lager av lipidmolekyler. I dessa lipider är membranproteinet tänkt att placeras och hitta sin naturliga form. Uttryck och upprening av MSP2N2, en typ av MSP som stabiliserar nanodiskar av lagom storlek för HaTRPA1, genomfördes med framgång. Insättning av HaTRPA1 i nanodiskar utfördes genom att blanda HaTRPA1, MSP2N2 och olika lipider. Separation baserat på storlek och analys av bildade komplex visade att formeringen av nanodiskar innehållande HaTRPA1 lyckades. Mätningar av HaTRPA1 i MSP2N2-nanodiskar, med dynamisk ljusspridning, visade en diameter på 25 nm. Även bilder från elektronmikroskopin, både kryo (Cryo-EM) och negativ färgning, visade en partikelstorlek på 25 nm. För vidare strukturstudier behöver uttryck och upprening av HaTRPA1 optimeras för att säkerställa att bildningen av nanodiskar med HaTRPA1 kan förfinas och upprepas under olika förhållanden. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/9079090
- author
- Tolevska, Veronika LU
- supervisor
- organization
- course
- KEMR45 20212
- year
- 2022
- type
- H2 - Master's Degree (Two Years)
- subject
- keywords
- Nanodisc, TRPA1, MSP2N2, biochemistry
- language
- English
- id
- 9079090
- date added to LUP
- 2023-06-28 13:50:39
- date last changed
- 2023-06-28 13:50:39
@misc{9079090,
abstract = {{Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) is a nonspecific cation channel activated by a wide range of stimuli. The polymodal receptor resides in the cell membrane of sensory neurons and plays a key role in nociceptive pain transmission. Environmental irritants such as allyl isothiocyanate, an electrophile found in wasabi, activate TRPA1. In this work, the goal was to lay the basis for structure, and so function and mechanism, studies of Hylobius abietis TRPA1 (HaTRPA1). The large pine weevil, H. abietis, feeds on the bark of conifer seedlings in European plantations, opposing the re-establishment of forests. A natural repellent could be developed targeting HaTRPA1, i.e., by developing agonists of solely HaTRPA1.
Membrane proteins can be solubilized in aqueous solution by reconstitution in nanodiscs. A nanodisc is a construct of a membrane scaffold protein (MSP) and lipids, which encircles the protein of interest. In this study, MSP2N2 and phospholipids (POPC, POPE and POPG) were used. The reconstitution of HaTRPA1 in MSP2N2 nanodiscs was studied by size exclusion chromatography. The chromatogram showed a separation of two peaks, possibly of empty nanodiscs and nanodiscs containing HaTRPA1. The sample of HaTRPA1 in MSP2N2 nanodiscs was studied by negative stain and single particle cryogenic electron microscopy. The imaging, and dynamic light scattering, of HaTRPA1 in MSP2N2 nanodiscs suggested particles with a size of approximately 25 nm. A truncated form of HaTRPA1 was studied, which lacked most of its peripheral part. Therefore, no clear protrusion from the disc was visible by imaging, and the presence of HaTRPA1 in nanodiscs could not be confirmed further. The amount of purified HaTRPA1 was insufficient, and thus the repeatability of the reconstitution experiment was not ensured. The expression of HaTRPA1 should be improved prior to advancements of structure studies.}},
author = {{Tolevska, Veronika}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Reconstitution of Hylobius abietis TRPA1 in MSP2N2 nanodiscs}},
year = {{2022}},
}