Tillämpning av en ny vätskekromatografi-tandem masspektrometri metod för analys av metylmalonat

Abstract

Abstract

Introduction: this study is about optimization and application of a new liquid chromatography tandem mass spectrometry method with reversed phase instead of HILIC column for analysis of methylmalonate.

Background: methylmalonate cannot be broken down if there is a low level of cobalamin. Therefore, the investigation of lack of cobalamin is supplemented with, among other things, methylmalonate analyzes. The analyzes are performed with LC-MS/MS instruments where an effective separation is required.

Aim(s): this study aims to optimize a new analysis method at LC-MS/MS for greater chromatographic separation of methylmalonate with reversed phase, as the current method is insufficient and has been discontinued.

Methods: optimization of parameters such as gradients of mobile phases, collision energy, temperature and flow established the rest of the study. Patient samples were then analyzed for validation of the new method. Linearity test of dilution series was made to examine up to which levels the method is linear within, test to determine the lowest detectable level of analyte, carry over test to minimize contamination and evaluation of signal/noise.

Results: concentrations of 40 µM gives a carryover of less than 0.03 µM, which is the lowest level of quantification. Comparison of methylmalonate between the theoretical values on the y-axis and the obtained values on the x-axis gave an explanatory rate (R2) of 99.94% and a strong correlation. The regression shows that the relationship is linear, and the linear function was calculated as y=0.6229x + 0.182. A Passing-Bablok regression analysis was made to compare the old method with the new which resulted in a strong linear relationship without neither systematic nor proportional differences.

Conclusion: comparison of the new optimized method with the old one has resulted in a good precision and agreement with each other, which would allow to be using this method for the analysis of methylmalonate.

Keywords: Liquid chromatography, methylmalonate, tandem mass spectrometry

Popular Abstract (Swedish)

Populärvetenskaplig sammanfattning

Vid kemiska analyser på laboratorium är det ofta nödvändigt att separera olika molekyler i en blandning med hjälp av vätskekromatografi. Vätskekromatografi är en separationsmetod där man använder sig av tvåfassystem. Masspektrometri är en teknik där joner separeras i gasfas baserat på deras massa i förhållande till laddning (m/z). En kombination utav dessa metoder kallas vätskekromatografi- tandem masspektrometri (LC-MS/MS). Genom att kombinera dessa två metoder kan man få en bättre och noggrannare separation och identifiering av olika molekylslag, till exempel molekylen metylmalonat (MMA) som är en markör för brist på vitamin B12.

I det här arbetet utfördes ett metodbyte och tillämpning av en ny analysmetod för LC-MS/MS för att kunna analysera molekylen metylmalonat (MMA) bättre. Man ville uppnå en bättre kromatografisk separation av metylmalonat med omvändfas, eftersom den nuvarande metoden var otillräcklig och har lagts ner. Undersökningsfrågorna som behandlades i arbetet var:

Vilka parametrar i MS-systemet är de mest kritiska?

Hur är inomdags- och mellandags-variationen med den nya metoden?

I vilken utsträckning smittar provet nästa prov?

Finns det något linjärt samband mellan prover i en spädningsserie?

Metodjämförelse för att ta reda på om det finns systematiska och proportioonella skillnader mellan HILIC och omvändfas.

Optimering av parametrar som gradienter av mobilfaser, kollisionsenergi, temperatur och flöde la grunden för resten av studien. Patientprover analyserades sedan för validering av den nya metoden. Linjäritetstest av utspädningsserier gjordes för att undersöka upp till vilka nivåer metoden är linjär inom, bestämma den lägsta detekterbara nivån av analyten, smittest för att minimera kontaminering och utvärdering av signal/brus.

Resultatet av smittester med koncentrationer upp till 40 µM ger en överföring på mindre än 0,03 µM, vilket är den lägsta kvantifieringsnivån. Jämförelse av metylmalonat mellan de teoretiska värdena på y-axeln och de erhållna värdena på x-axeln gav en förklaringsgrad (R2) på 99,94 % och en stark korrelation. Regressionen visar att sambandet är linjärt, och den linjära funktionen beräknades som y=0,6229x + 0,182. En Passing-Bablok regressionsanalys gjordes för att jämföra den gamla metoden med den nya vilket resulterade i ett starkt linjärt samband utan vare sig systematiska eller proportionella skillnader.

Jämförelse av den nya optimerade metoden med den gamla har resulterat i en god precision och överensstämmelse med varandra, vilket skulle göra det möjligt att använda denna metod för analys av metylmalonat.

• author: Wawerek, Iga
• supervisor: Per Bengtsson
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMK10 20222
• year: 2023
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Chemistry
• keywords: Analytical chemistry, Liquid chromatography, methylmalonate, tandem mass spectrometry
• language: Swedish
• id: 9112997
• date added to LUP: 2023-04-04 13:07:06
• date last changed: 2023-04-04 13:07:06