Investigating the interaction between CLIP2 and AQP5

Abstract

Introduction: The aim of this project is to study if the predicted model of the interaction between aquaporin-5 (AQP5) and CLIP2 is accurate by introducing single point mutations in the predicted interaction site of CLIP2 and see if it affects the interaction or not.
Background: Aquaporins are essential membrane proteins for many biological processes. The regulation of aquaporins is crucial for cell functioning and survival. Aquaporins are regulated by other proteins and that is why there is an interest in studying interactions between aquaporins and other proteins. Defects in regulation of aquaporins can cause several diseases, such as Sjogren’s syndrome. This report will focus on aquaporin-5 and CLIP2, which is a protein recently discovered to interact with and regulate AQP5. A binding model has been predicted and to be able to confirm or reject this model, the protein interaction needs to be studied in vitro.
Aim(s): How do mutations in the predicted interaction site of CLIP2 affect its interaction with aquaporin-5?
Methods: To generate the mutations in CLIP2, a two-stage PCR method was used. The mutated plasmids were cloned into BL21, where the protein was expressed in large scale before being purified using IMAC and SEC. AQP5 expressed in Pichia pastoris was purified using IEC and SEC. The interaction between each CLIP2 mutant and AQP5 was measured using microscale thermophoresis (MST).
Results: The introduction of mutations in the DNA, expression and purification of the final mutated proteins were successful. The purification of AQP5 was unsuccessful, however, the final measurements in MST could still be executed by using another AQP5 batch.
Conclusion: The lack of binding or weakening of binding, which was observed for every mutant, supports the predicted binding model stating that the four mutated amino acids are involved in the interaction between AQP5 and CLIP2.
Keywords: Aquaporin-5, CLIP2, microscale thermophoresis, mutagenesis PCR.

Popular Abstract (Swedish)

Människokroppen består av en otalig mängd celler, där varje enskild cell är omsluten av ett så kallat membran. Likt ett äpple där skalet omsluter och skyddar fruktköttet skyddar membranet cellen. En cell kan inte överleva utan ett membran. Förutom membranet är cellen också beroende av en fungerande transport av vatten och andra näringsämnen över membranet. För att kunna transportera ämnen över membranet finns det proteiner som sitter tvärsöver membranet och bildar kanaler genom membranet genom vilka olika ämnen kan flöda in eller ut ur cellen. Olika typer av proteiner används beroende på vad som ska transporteras. För transport av vatten används en typ av proteiner som kallas för aquaporiner. Aquaporiner kan aktiveras eller inaktiveras beroende på om vatten behöver transporteras eller inte. Det finns flera faktorer som bidrar till att en aquaporin aktiveras eller inaktiveras, varav ett sätt är om ett annat protein binder till aquaporinen. Ett protein består av en kedja av sammanlänkade aminosyror och när två proteiner interagerar med varandra så innebär det att några av aminosyrorna i de båda proteinkedjorna binder till varandra.
I detta projekt kommer bindningen mellan en typ av aquaporin, aquaporin-5 (AQP5), och proteinet CLIP2 att studeras. Idag finns det många datorprogram som kan förutspå hur bindningar mellan proteiner ser ut utifrån proteinernas egenskaper och hur bindningar mellan strukturellt liknande proteiner ser ut. Utifrån detta har man kunnat förutspå hur bindningen mellan CLIP2 och AQP5 ser ut, det vill säga vilka aminosyror som interagerar med varandra, men för att vara säker på att bindningsmodellen stämmer måste det bekräftas experimentellt. I detta projekt har fyra varianter av CLIP2 producerats, där varje version skiljer sig från det naturliga CLIP2 proteinet med bara en aminosyra. Med hjälp av en metod som heter PCR har en aminosyra muterats, det vill säga bytts ut, mot en annan aminosyra för att kunna avgöra om den aminosyran som togs bort haft någon betydelse för bindningen. Om aminosyran är viktig kommer det att visa sig genom att CLIP2 inte längre kan binda till AQP5 eller att bindningen blir mycket svagare. Detta kan detekteras med hjälp av en metod som heter MST.
Resultaten visade att CLIP2 fortfarande kan binda till aquaporinen, även fast att en mutation introducerats, men att bindningen är betydligt mycket svagare. För en av de fyra undersökta mutationerna kunde proteinet inte längre binda alls till aquaporinen. Detta resultat pekar på att den förutspådda bindningsmodellen sannolikt stämmer bra överens med hur proteinerna interagerar i verkligheten.

• author: Rasmusson, Tove
• supervisor: Susanna Törnroth-Horsefield
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMR10 20241
• year: 2024
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Chemistry
• keywords: biochemistry, aquaporin-5, CLIP2, microscale thermophoresis, mutagenesis PCR
• language: English
• id: 9163585
• date added to LUP: 2024-06-20 14:40:08
• date last changed: 2024-06-20 14:40:08