Methods to explore reactions of sialic acid derivatives

Abstract

N-Acetylneuraminic acid (Neu5Ac) is the most common form of sialic acid, a nine-carbon sugar often situated at the ends of glycoconjugates. Its unique reactivity makes it a complex substrate to work on, but new methods are continuously developed. In 2007, Ye et.al. reported a regioselective substitution by morpholine on position 4 of fully acetylated Neu5Ac, with retained stereochemistry. The anomeric hydroxyl became deprotected in the process, and it turned out that starting the reaction with tetra-acetylated Neu5Ac increased the rate of the reaction. Our group has since then expanded the scope of the reaction by testing different nucleophiles. We initially hypothesized that an electron pair on the anomeric hydroxyl activates position 4 via through-space interactions by donating into the antibonding orbital of C-O, enabling an attack by the neighboring amide group to form a reactive oxazoline intermediate. Here we further investigate the reaction. The first part of the thesis focuses on the synthesis of an analog to tetra-acetylated Neu5Ac with deuterium incorporated at position 4, with hopes of using it to study the secondary kinetic isotope effect. This was not attained, as several steps in the synthesis were low-yielding, and the last deprotection did not yield any product.
The second part of the thesis accounts for the results of a series of NMR experiments of the reaction with p-thiocresol as the nucleophile, where the goal was to investigate if the oxazoline formation is the rate-determining step. We found that the reaction does not follow first-order kinetics in experiments where stoichiometric amounts of p-thiocresol are used but displays pseudo-first-order kinetics in experiments where p-thiocresol is added in excess, indicating that the nucleophilic attack is the rate-determining step. The experiments showed that the rate is dependent on temperature and base, although it is not clear from the experiments whether the base acts catalytically or has a pH effect. The NMR spectra also revealed two peaks with the kinetic behavior of intermediates, which does not comply with our initial hypothesis featuring a single intermediate. Since the reaction requires the anomeric hydroxyl to be free, we hypothesize that the reaction proceed via the open-form conformation, which would include several intermediates. It is also a possibility that water is an active part of the reaction, as the NMR water peak shifted and changed appearance during the reaction. Water, alkaline conditions, and temperature all affect the mutarotation of carbohydrates, and the difference in rates presented in this report might be an indication of that. Finally, we started a synthesis of an analog of tetra-acetylated Neu5Ac containing a tri-fluorinated amide. Although this analog could not be tested due to time constraints, it is a promising substrate to monitor in the future – hopefully elucidating to what extent the amide influences the reaction.

Popular Abstract (Swedish)

Att ta reda på hur och varför reaktioner sker molekyler emellan är ingen lätt uppgift. Ingen kamera är tillräckligt liten eller känslig (än) för att filma det som händer på molekylnivå. Istället behöver forskare genomföra experiment och samla stora mängder data för att få en bild av hur en reaktion går till, den så kallade reaktionsmekanismen. Att ta reda på reaktionsmekansimer ökar förståelsen för hur molekyler reagerar med varandra, vilket är väsentligt för hela det kemiska forskningsfältet. I den här rapporten undersöker vi en syntetisk variant av en kolhydrat som kallas sialinsyra. Sialinsyra finns överallt i kroppen och sitter ofta längst ut på kolhydratkedjor, där en mängd olika modifikationer av kolhydraten har upptäckts. Att modifiera sialinsyra i labbet är däremot komplicerat, och forskare söker ständigt nya metoder. År 2007 rapporterades en reaktion där en funktionell grupp på ett sialinsyraderivat byttes ut mot en annan molekyl. Den inkommande molekylen var en så kallad nukleofil, en elektronrik molekyl som kan attackera elektronfattiga positioner på andra molekyler. Det speciella med reaktionen var att det fanns flera funktionella grupper av samma slag, ändå reagerade nukleofilen med endast en av dem. Dessutom satt nukleofilen i produkten pekandes i samma riktning som den lämnande gruppen gjort, vilket inte tillhör vanligheterna för den typen av reaktioner; vanligtvis pekar den inkommande gruppen i motsatt riktning, eller så skapas en blandning av molekyler med den inkommande gruppen pekandes i olika riktningar. Vår forskningsgrupp har fortsatt undersöka den här reaktionen och testat olika nukleofiler. Frågan kvarstår dock: hur går det till? Den initiala hypotesen var att sialinsyraderivatet först reagerar med sig själv för att bilda en mer reaktiv molekyl, ett intermediat, som är särskilt aktiverat i en position. Nukleofilen attackerar sedan den aktiverade positionen, och strukturen på intermediatet bestämmer i vilken riktning nukleofilen pekar i produkten.
Målet med det här arbetet var att närmare undersöka reaktionen. Rapporten är uppdelad i två delar; i den första delen försöker vi skapa en molekyl lik sialinsyraderivatet som används i reaktionen, men där vi byter ut ett väte i reaktionscentret mot en isotop av väte som kallas deuterium, eller tungt väte. Målet var att se hur det nya derivatet skulle reagera jämfört med det gamla, men tyvärr kom vi inte fram till slutmålet då syntesen innehöll flera reaktionssteg som inte fungerade särskilt bra. I del två av rapporten undersöker vi istället reaktionen genom en teknik som kallas Nuclear Magnetic Resonance, eller NMR. I de experimenten framkommer det att mängden nukleofil påverkar reaktionen, vilket inte var vad vi ursprungligen trott. Det visar sig också att fler faktorer påverkar reaktionen, bland annat om bas finns med eller inte, samt temperaturen. Vi spekulerar även om vatten kan ha en roll i reaktionen, även om det bara finns små mängder närvarande. I NMR-experimenten har vi observerat att vatten i reaktionen ändrar karaktär under reaktionens gång. Resultaten från NMR-experimenten visar även att det troligtvis finns mer än ett intermediat, vilket också motsäger vår ursprungliga hypotes. Slutligen föreslår vi en reaktionsmekanism som innefattar att sialinsyraderivatet går från en sluten ring-konformation till en öppen konformation innan nukleofilen attackerar. I framtiden kan sialinsyraderivatet modifieras ytterligare för att användas i jämförande studier jämte originalet, och på så sätt ge fler ledtrådar om hur reaktionen går till.

• author: Zuleta Sjögren, Isolde
• supervisor: Joachim Björklund
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMR30 20241
• year: 2024
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Chemistry
• keywords: Sialic acid, Neu5Ac, Reaction Mechanism, Nuclear Magnetic Resonance, Carbohydrate Chemistry, Synthesis, Deuteration
• language: English
• id: 9171680
• date added to LUP: 2024-08-15 10:03:55
• date last changed: 2024-08-15 10:03:55