Development of the gastrointestinal tract in young mammals : Effects of enteral provocation with protease or phytohaemagglutinin in neonatal rats

Abstract

The rat, as an altritial species, is born with an immature gastrointestinal tract and intestinal barrier function, which is highly absorptive to milk-borne bioactive molecules that can pass undigested and reach the general circulation of the suckling newborn. This passage occurs by the neonatal-Fc-receptor (FcRn) binding and trancytosis of immunoglobulin G in the proximal small intestine (SI) and by the highly endocytic vacuolated enterocytes
non-selectively in the distal SI. Postnatal gut maturation accelerates at weaning, around postnatal day 21, coincident with the dietary transition from milk to solid food. Maturation of the gut can also be precociously induced by provocation with a lectin, phytohaemagglutinin (PHA), mimicking the naturally occurring changes in gut structure and function. The changes occurring during natural or induced gut maturation include stimulation of pancreatic function and cessation of the SI absorptive capacity to macromolecules (gut closure). Intestinal epithelial maturation has been related to the gut immune system and is suggested to depend on T-lymphocytes activation. Recently, the transcription factor B-lymphocyte-induced maturation-protein-1 (Blimp-1) has been proposed to be a key regulator of intestinal maturation in mice. Hence, the present study investigated the events occurring during gut development and the cues initiating the process. The study especially focused on changes in the barrier function and macromolecular permeability, pancreatic function, and the relation to gut immune factors.
A novel animal model of pancreatic and pancreatic-like protease-induced precocious gut maturation was established in neonatal rats, and was used in comparison to the existing PHA-induced model, as well as natural gut development. The gut maturational changes observed during natural or induced maturation, by both protease or PHA, included the transition of foetal- to adult- type SI epithelium, with reduced FcRn expression in the proximal part and disappearance of vacuolated enterocytes in the distal part, associated with a similar change in intestinal epithelial Blimp1 expression. The early effects after exposure to the provocative agents, PHA and protease, revealed that both agents hampered macromolecular permeability and only protease also caused an increase in epithelial leakiness of the distal SI. These results indicated that protease and PHA affected the intestinal barrier function differently. Furthermore, the provocative agents were also tested in neonatal athymic nude rats, T-cell immunodeficient, and they appeared to be susceptible to induced precocious gut maturation. These results suggested that gut maturation is independent of thymus-derived T-celsl, but the involvement of other immune cells types, possibly innate immune cells, should be further investigated.
Thus, the findings of the present thesis will contribute to an increased understanding of initiating cues and the mechanisms of maturation of the intestinal barrier in young mammals. The knowledge obtained could be applied to improve strategies for the treatment of gut-related complications, often affecting premature infants.

Abstract (Swedish)

Råttan är en däggdjursart med en kort dräktighetstiden och föds därför mycket omogen. Den är vid födelsen naken, blind och döv och är helt beroende av sin moder för många funktioner, såsom näringstillförsel, termoreglering, urinering och tarmtömning. Under diperioden är råttans mag-tarmsystem och matsmältning helt anpassad till modersmjölkdieten. Bland annat är tarmens barriärfunktion omogen, vilket möjliggör en passage av intakta bioaktiva mjölkmolekyler till blodcirkulationen hos diande råttor. Bukspottkörteln funktion, som utsöndrar matsmältningsenzymer, är också låg vilket underlättar upptaget av intakta bioaktiva makromolekyler från mjölken. Detta upptag av, t.ex., antikroppar, hormoner och antimikrobiella komponenter, är viktigt för att ge avkomman ett skydd mot infektioner (passiv immunitet) tills det egna immunsystemet har mognat.
Passagen av makromolekyler över den omogna tunntarmen sker genom ett selektivt receptor-medierad upptag av antikroppar efter inbindning till den neonatala Fc-receptorn (FcRn) vilken uttrycks i den första proximala halvan av tunntarmens epitel (arbete II). Celler med en hög absorptionsförmåga, som särskiljs med en stor cell-vakuolen som upptar nästan hela cellens volym, utgör samtidigt det mesta av epitelet i den andra distala halvan av tunntarmen, (arbete II). Dessa egenskaper i den omogna tarmens slemhinna korrelerar till överföringen av den passiva immuniteten under diperioden.
Vid avvänjningen, d.v.s. vid övergången från mjölk till en diet med fast föda, accelererar mognaden av tarmen. De förändringar som sker, inkluderar ett utbyte av de omogna tarmepitelcellerna med mer mogna typer, som kännetecknas av ett minskat uttryck av antikroppsreceptorn och frånvaro av de hög-absorptiva vakuoliserade cellerna. Tarmens barriärfunktion ökar också drastiskt vid ”gut closure” med en förlust av den upptagskapaciteten för makromolekyler (arbete II, III och IV). Dessutom ökar bukspottkörtelns funktion vid avvänjningen (opublicerad data) och utsöndringen av pankreasenzymer stimuleras vilket visas i våra modeller med inducerad tarmmognad (arbete III och IV).
Tarmmognad kan också induceras experimentellt och vi har utvecklat två olika modeller av inducerad tarmmognad i diande råttor genom att experimentell mata, dels med ett lektin från röda kidneybönor, fytohemagglutinin (PHA), och dels med proteaser, protein-nedbrytande enzymer (arbete I). Dessa experiment modeller med brådmognad av tarmen efterliknar de förändringar som naturligt sker vid avvänjning, men under en mer kontrollerad tidsram och förhållanden.
De tidiga effekterna orsakade av behandling med de två provokativa substanserna har gett oss en bättre förståelse av de utlösande mekanismerna ledande till tarmmognad. Behandling med PHA gav en omedelbar blockering av all passage av makromolekyler över tarmväggen. Proteas-behandling blockerade både, den specifika och ospecifika vesikulära transportvägen, men skapade också ett läckage mellan cellerna, resulterande i en ökad permeabilitet i den distala delen av tunntarmen (pappers IV). Dessa resultat tyder på att de två substanserna har olika mekanismer för att provocera tarmmognad.
Tarmens immunsystem har också satts i samband med mognaden av tarmen hos unga råttor och T-lymfocyter har föreslagits som viktiga modulatorer. Nyligen har en immuncells-relaterad transkriptionsfaktor, Blimp-1, utpekats som en viktig hämmare av tarmepitelceller mognad hos möss. Därför studerades Blimp1 i tunntarmen hos råtta och resultaten visade ett minskat uttryck, vältajmat med ökad mognad (papper II). Effekter av immunsystemet, särskilt T-celler, på tarmmognaden studerades också med hjälp av en modell med nakna råttor, vilka har ett nedsatt immunförsvar eftersom de saknar tymus, organet där T-celler utvecklas. De nakna råttorna verkade vara normalt känsliga för tarmprovokation eftersom brådmognad av tarmen kunde även induceras i dessa råttor (arbete III). Resultaten tyder därför på att mognad av tarmen är oberoende av tymus T-celler, men det kan finnas andra typer immuncell inblandade i processen.
De utvecklingsmässiga förändringar som sker vid avvänjningen har också satts i samband s.k. "fysiologisk inflammation", med rekrytering av immunceller till tarmen. Det har tidigare visats att inducerad brådmognad av tarmen medför en rekryteringen av lymfocyter men fler studier behövs. Som stöd för detta fann vi ett ökat barriärläckage efter provokation med proteaser vilket tyder på att en inflammatorisk process sker (arbete IV).
Min avhandling belyser tarmens utveckling efter födseln, m.h.a en modell med nyfödda råttor, med fokus på tarmens barriärfunktion, bukspottkörtelns funktion, och i relation till tarmens immunsystem, med speciellt focus på de tidiga utlösande mekanismerna. Detta studerades, både vid naturlig och experimentellt inducerad brådmognad av tarmen, med provokationsmodeller som utvecklats i vårt labb. Resultaten som framkommit bidrar med ny kunskap och en bättre förståelse för vad som utlöser mognad av tarmbarriären hos nyfödda och kan förhoppningsvis bidra till att förbättra eller utveckla nya strategier för behandling av tarmrelaterade komplikationer som ofta uppkommer hos förtidigt-födda barn.

• author: Arevalo Sureda, Ester
• supervisor: Björn Weström; Stefan Pierzynowski; Olena Prykhodko
• opponent: Associate Professor Pérez-Cano, Francisco José, Department of Biochemistry and Physiology, University of Barcelona, Spain
• organization: Functional zoology
• publishing date: 2017-03
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Natural Sciences
• keywords: gut, Intestine, Pancreas, development, precocious, protease, PHA, enterocytes, permeability, endocytosis, IgG, FcRn, Blimp1, T-lymphocyte, passive immunity, altricial, neonatal, suckling, athymic, rat, immunohistochemistry (IHC)
• pages: 182 pages
• defense location: Lecture hall A213, Biology building A, Sölvegatan 35, Lund
• defense date: 2017-03-31 13:00:00
• ISBN: 978-91-7753-182-1
• ISBN: 978-91-7753-183-8
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 1005d6f6-5ba2-4d1e-90fa-891a3aa3a67d
• date added to LUP: 2017-03-07 10:29:33
• date last changed: 2018-11-21 21:30:29