WILMS’ TUMOUR GENE 1 PROTEIN (WT1) – AN EFFECTOR IN LEUKEMOGENESIS?

Abstract

Wilms’ tumour gene 1 (WT1) encodes a zinc-finger transcription factor functioning as a key regulator in organ development. WT1 was first identified as a tumour suppressor gene due to its inactivation in Wilms’ tumour cases, a childhood kidney cancer. In adult tissues WT1 expression is restricted to few organs, but various forms of cancers express high WT1 levels, suggesting an oncogenic potential for WT1.

In normal hematopoiesis WT1 is expressed in a small subset of early progenitor cells, with declining levels as maturation occurs into mature blood cells. However, most primary leukemias express high levels of WT1 at diagnosis and this is an independent predictor of adverse outcome. In paper I, I demonstrate that WT1 expression is induced by tyrosine kinase signalling from BCR/ABL1 via the PI3K/Akt pathway. Chronic myeloid leukemia (CML) cells with forced expression of WT1 showed enhanced resistance to apoptosis induced by the ABL1 tyrosine kinase inhibitor, imatinib, further proposing an oncogenic function for WT1.

Interferon regulatory factor 8 (IRF8), is absent or expressed at very low levels in leukemia. In paper II, IRF8 was shown to be a direct target gene of WT1, repressed by WT1 both in human hematopoietic progenitor cells and in leukemic cell lines. Furthermore, a strong anti-correlation between WT1 mRNA and IRF8 mRNA levels was observed when analyzed in a compiled compendium of expression datasets from primary leukemia samples.

WT1 was retrovirally transduced in CD34+ progenitor cells to investigate the function of high WT1 levels in these cells. An oligonucleotide array revealed N-myc downstream regulated gene 2 (NDRG2), as an upregulated target gene to WT1. NDRG2 has later been identified as one of the genes in the HSC signature, which may suggest an indirect impact on HSC self-renewal capacity mediated by WT1 via regulation of NDRG2.

In paper IV a delayed maturation of CD34+ human progenitor cells with forced expression of a WT1-mutant, lacking the entire zinc-finger domain and termed WT1(delZ), was observed. Enhanced and prolonged proliferation, increased clonogenic growth and differentiation towards an erythroid phenotype of WT1(delZ) expressing cells, suggest an oncogenic gain-of-function for mutated WT1, as compared to wild-type WT1. WT1 mutations are found in AML and T-ALL and are predominantly heterozygous frameshift mutations affecting exon 7, resulting in premature stop codons, thus encoding truncated WT1, similar to the WT1(delZ) protein. AML patients with WT1 mutations have higher frequency of resistence to chemotherapy with worse disease-free and overall survival rate.

In summary, the abovementioned experimental findings, thoroughly discussed in my thesis, in association with the prevalence of high wild-type WT1 levels and WT1-mutations found in leukemias indicate an oncogenic effector role for WT1 in leukemogenesis.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

SVENSK SAMMANFATTNING (SUMMARY IN SWEDISH)

Hematopoes och leukemi

Hematopoes är benämningen på den process vari alla blodceller genom hela livet kontinuerligt utvecklas i benmärgen, samt vid bildandet av lymfocyter även i lymfkörtlarna. Varje dygn bildas det ca 1012 nya celler i benmärgen för att ersätta uttjänta blodceller som dör och bryts ned. Ett litet antal stamceller i benmärgen ansvarar för att hematopoesen kan fortgå. Nivån av stamceller hålls konstant genom att de vid celldelning bildar antingen nya stamceller eller förstadier till blodceller, som i en utmognadsprocess slutligen blir mogna röda blodkroppar (erytrocyter), vita blodkroppar (granulocyter, monocyter och lymfocyter) och blodplättar (trombocyter.

Hematopoesen regleras i ett komplext system med samspel mellan speciella proteiner som benämns tillväxtfaktorer och transkriptionsfaktorer, vilka är proteiner som binder till gener i cellernas DNA och aktiverar eller förhindrar uttryck från generna. De mogna blodcellerna transporteras ut i kroppen för att utföra sina specifika funktioner. De röda blodcellerna är syretransportörer. Vita blodceller är viktiga i immunförsvaret vid infektioner och blodplättarna är nödvändiga för att förhindra blödningar och deltar i blodets koagulering.

Leukemi är samlingsnamn för en rad elakartade cancerformer som drabbar de blodbildande cellerna. Omvandlingen från en normal cell till en leukemisk cell beror på uppkomna genetiska förändringar i de hematopoietiska stamcellerna eller i tidiga hematopoietiska celler, vilket leder till förhindrad utmognad av funktionella blodceller och en ansamling av vita omogna blodceller i benmärgen och i blodet. Obehandlade akuta leukemier leder snabbt till döden på grund av den kraftiga expansionen av leukemiceller i benmärgen och till följd av detta få normala blodceller i blodet. Patienterna lider ofta av blodbrist och stor infektionskänslighet. Akuta leukemier drabbar både barn och vuxna, medan kronisk leukemi förekommer främst bland vuxna. Kroniska leukemier omvandlas ofta med tiden till mer aggressiva, akuta leukemier. Troligen orsakas denna utveckling av ytterligare genetiska avvikelser med förändringar i funktionen för transkriptionsfaktorer samt aktivering av andra cellsignaleringsvägar.

Trots att det idag finns relativt mycket kunskap om genetiska förändringar som är förknippade med utveckling av leukemi, så är de faktorer som styr omvandlingen från en normal cell till en leukemisk cell till stor del fortfarande inte klargjorda.

Wilms’ tumör gen 1 och leukemi

Wilms’ tumör gen 1 (WT1), är en transkriptionsfaktor som uttrycks i en liten andel av tidiga stamceller, minskar under utmognaden av blodcellerna och som inte återfinns i normala mogna blodceller. Detta skulle kunna innebära att en minskning av WT1 proteinet under utmognad är det normala och är nödvändigt för att tillåta utmognadsprocessen.

Många leukemier hos både barn och vuxna har höga nivåer av WT1 vid diagnostillfället, vilket ofta innebär en sämre prognos för patienten. Genetiska förändringar, mutationer, i WT1 genen återfinns i en del av leukemierna, vilket innebär en ökad risk för resistens mot behandling. WT1-mutationerna leder ofta till ett WT1 protein som saknar den proteindelen som kan binda till DNA, vilket innebär att mutanten inte kan reglera de gener som WT1 normalt binder till. Förändrade egenskaper och förvärvade nya egenskaper för WT1-mutanten kanske bidrar till utmognadsblockaden och ger WT1 en onkogen roll i utvecklingen av leukemi.

Min forskning

För att undersöka effekter av WT1 och mekanismer för hur WT1 påverkar celldelning och utmognad av blodceller, så överuttrycktes WT1 och WT1-mutanten i tidiga omogna celler. I mina försök medförde WT1-mutanten, som inte kan binda till DNA, en förlängd ökad celltillväxt och utmognad i den riktning som leder till bildning av röda blodceller. Normalt WT1 medförde däremot minskad tillväxt av både vita och röda blodceller. Den exakta mekanismen som styr WT1-mutantens påverkan på celltillväxten är ännu inte klargjord, men jag har resultat som indikerar att transkriptionsfaktorn STAT5 kan vara involverad i denna process.

För att försöka identifiera gener som WT1 reglerar i leukemier med högt WT1 uttryck, gjordes en analys av förändrade genuttryck i humana tidiga blodceller med överuttryckt WT1 jämfört med kontrollceller. Jag hittade en gen som aktiveras av WT1, N-myc downstream regulated gene 2 (NDRG2). Betydelsen av detta fynd är inte helt uppenbar, men NDRG2 har senare visat sig vara en av de gener som styr hematopoetiska stamceller. Detta skulle kunna innebära att WT1 via NDRG2- reglering indirekt kan påverka stamcellernas funktion.

Jag identifierade även en transkriptionsfaktor, Interferon regulatory factor 8 (IRF8), vars gen WT1 proteinet binder till, vilket medför sänkt uttryck från IRF8 genen. Betydelsen av detta fynd bekräftades vid undersökning av ett stort patientmaterial från primära leukemier, där jag fann en stark anti-korrelation mellan WT1 och IRF8 nivåer.

Mina studier bekräftade fynd presenterade i tidigare rapporter att onkoproteinet BCR/ABL1 ger förhöjda WT1 nivåer och jag påvisade dessutom vilken specifik cellsignalleringsväg som är aktiv i denna process. Celler med överuttryckt BCR/ABL1 visade förhöjda WT1 nivåer och sänkta IRF8 nivåer, både på genuttrycksnivå och proteinnivå i mina försök och detta speglar förhållandet i de leukemiceller där BCR/ABL1 finns närvarande.

Jag tror att WT1 proteinets roll i leukemogenesen är mångfacetterad, men genom att karakterisera olika molekylära mekanismer som WT1 proteinet styr, både i sin full-längds form och som WT1-mutant, så kan man så småningom använda denna kunskap i utvecklingen av riktad terapi som leukemibehandling.

• author: Vidovic, Karina
• supervisor: Urban Gullberg; Tor Olofsson
• opponent: Dan, Grandér, Avdelningen för onkologi-patologi, Karolinska institutet, Stockholm
• organization: Division of Hematology and Transfusion Medicine; Hematology-lup-obsolete (research group); BioCARE: Biomarkers in Cancer Medicine improving Health Care, Education and Innovation
• publishing date: 2010
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Hematology
• keywords: WT1(delZ), leukemia, BCR/ABL1, hematopoiesis, NDRG2, IRF8, WT1
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2010:83
• pages: 142 pages
• defense location: BMC, D15, Belfragesalen
• defense date: 2010-10-01 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86443-99-3
• language: English
• LU publication?: yes
• id: b20caa26-494c-464b-a59d-928387e68845 (old id 1668182)
• date added to LUP: 2016-04-01 15:02:57
• date last changed: 2023-04-18 20:01:42