Novel Agonists and Antagonists of Platelet Receptors

Abstract

Platelets are central for the primary haemostatis. The platelet has surface bound receptors that are vital for the platelet activation. One of these receptors, the purinergic ADP-activated G-protein coupled receptor (GPCR) P2Y12 is a key receptor for platelet activation, and thus for thrombus formation, which makes P2Y12 a target in pharmaceutical antiplatelet therapies. As a complement during revascularization surgery, mild hypothermia has been accepted, but its effect on platelet activation is unclear. We performed a comparative ex vivo study on platelets, treated with mild hypothermia and normothermia in the presence of P2Y12 inhibitors. We found that mild hypothermia increased platelet P2Y12 activation and that the P2Y12 inhibitor, clopidogrel, lost in efficiency. The P2Y12 receptor is also present on vascular smooth muscle cells (VSMC), promoting contractions. We initiated a comparative study on human and murine artery tissue to evaluate if any of the antiplatelet substances, clopidogrel and ticagrelor (AZD6140) a reversibly non-prodrug P2Y12 inhibitor, could inhibit P2Y12 signaling also on VSMC. The results showed that ticagrelor was able to inhibit P2Y12 stimulated vasoconstriction, while clopidogrel had no effect. The succinate GPCR (SUCNR1) mRNA has been found at high levels in platelets. We performed a study on SUCNR1 to investigate its function in platelets. The study showed that the succinate receptor was expressed as a membrane bound Gαi-protein. Succinate per se could mediate platelet activation. It was dependent on P2Y12 activation, tromboxane A2 release and PI3Kβ signaling. By screening intermediates in the mevalonate pathway, i.e. the cholesterol synthesis, we found that one of them, farnesyl pyrophosphate (FPP), had an antagonistic effect on ADP induced platelet activation. Further investigation on FPP with [35S]GTPγS binding and docking studies confirmed that FPP is an endogenous antagonist on the platelet P2Y12 receptor.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Hjärt- och kärlsjukdomar är den främsta orsaken till en för tidig död för både män och kvinnor i dagens industrialiserade samhällen. I det akuta förloppet av dessa sjukdomar spelar blodplätten (trombocyten) en viktig roll då den är inblandad i bildandet av blodproppar. Den kärnlösa och kortlivade trombocytens roll är vanligen en annan och central i läkningsprosessen av skadade blodkärl. Vid en kärlskada organiserar sig trombocyterna med trådverk av samverkande proteiner för att levra (koagulera) blodet och därmed blodförlust. Trombocyterna använder sig av ytbundna receptorer och frisättning av signalmolekyler för att kommunisera med sin omgivning. En av dessa receptorer, P2Y12 är viktig för att aktivera trombocyten. P2Y12 finns även på ytan av glatt muskulatur i blodkärlsväggen, där den svarar med att kontrahera muskelcellen. Flera läkemedel, däribland clopidogrel och ticagrelor har utvecklats för att förhindra att P2Y12 aktiveras. Clopidogrel måste omvandlas via levern för att aktiveras, vilket innebär att clopidogrel föreligger i låga koncentrationer i blodplasman. Clopidogrel har också påvisats ha en låg effektivitet vid behandling. Ticagrelor är en substans som tillhör den nya generationen P2Y12 blockerare som visat sig ha en bättre blockerande effekt på trombocyter än sina föregångare.



Det finns ett behov av att ta fram nya terapier för att sänka trombocytaktiveringen. Genom att sänka kroppstemperaturen från 37C till 33C (mild hypotermi) sänks kroppsmetabolismen och behovet av syre till organ och vävnader. Detta har gett positiva resultat vid hjärt- och kärlkirurgi, och visat sig vara en metod för att skona vävnad strax innan samt under de kirurgiska ingreppen. Dock har studier på trombocytens svar vid mild hypotermi visat på både en ökad respektive minskad aktivering. Vid en undersökning kunde vi konstatera en ökad trombocyt aktivering vid 33C jämfört med 37C. Vid samma undersökning kunde vi bekräfta att även effektiviteten hos clopidogrel sänktes vid 33C jämfört med 37C.



Eftersom P2Y12 receptorn även uttrycks i glatt muskulatur så skulle i teorin en blockerande substans för P2Y12 receptorn, antingen clopidogrel eller ticagrelor kunna blockera dess aktivering på muskelcellerna i kärlen och förhindra skadliga kärlsammandragningar. Våra undersökningar visade att kontraktionerna i den glatta muskulaturen hämmades utav ticagrelor, medan clopidogrel var verkningslöst. Vi har vid tidigare undersökningar på trombocyter identifierat höga transkriptnivåer för succinatreceptorn (SUCNR1). Vid vidare undersökningar upptäckte vi att denna receptor fanns uttryckt på trombocytens yta och har en egen såväl som förstärkande effekt på trombocyt-aktivering. Aktivering av SUCNR1 visade sig vara beroende av P2Y12 aktivering, frisättning av tromboxan A2, såväl som det SUCNR1 aktiverade PI3Kβ enzymet.



Ett något oväntat fynd gjordes vid en undersökning av signalmolekyler, inblandade i kolesterol-syntesen. Det visade sig att en av signalmolekylerna, farnesyl pyrofosfat (FPP), uppvisade en hämmande effekt på ADP medierad trombocyt aktivering. Preliminära försök visade att det endast var den ADP aktiverade P2Y12-receptorn som blockerades genom närvaro av FPP. Vid senare underökningar kunde vi bekräfta att FPP, vid moderata koncentrationer, verkade hämmande på P2Y12-receptorn, men också att FPP vid låga koncentrationer kan fungera additivt på ADP/P2Y12-medierad trombocyt-aktivering.



Sammanfattningsvis har dessa arbeten, var och en på sitt vis, verkat för en kliniskt och prekliniskt ökad kunskap om trombocytaktivering. Genom studierna angående trombocytaktivering under påverkan av mild hypotermi, har vi visat att kyla ökar trombocytaktivering samt att clopidogrel förlorar en del av sin P2Y12-blockerande effekt. Den kliniska relevansen består i att behålla doserna av anti-trombotiska läkemedel även i de fall där mild kylning används som ett komplement vid operativa ingrepp. Vidare har våra försök visat att P2Y12-hämmaren ticagrelor även har en hämmande effekt på ADP stimulerad P2Y12-receptor inducerad kärlkontraktion, vilket kan vara en viktig terapeutisk egenskap i de fall där kärlväggen är skadad med frilagd underliggande glatt muskulatur. Vi har också identifierat succinat receptorns bakomliggande funktioner för medverkan i trombocytaktivering. Till sist har våra studier visat en ny roll hos en viktig molekyl i kolesterol syntesen, farnesyl pyrofosfat, nämligen den att farnesyl pyrofosfat även visat på antagonistiska- såväl som agonistiska egenskaper på den för trombocyt-aktivering centrala P2Y12 receptorn.

• author: Högberg, Carl
• supervisor: David Erlinge; Björn Olde
• opponent: Professor Bengtsson, Torbjörn, School of Health and Medical Sciences, Örebro University
• organization: Cardiology
• publishing date: 2011
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cardiac and Cardiovascular Systems
• keywords: Platelets, P2Y12, SUCNR1, FPP, hypothermia
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2011:3
• pages: 130 pages
• defense location: Segerfalksalen,Wallenberg neurocentrum, BMC, Sölvegatan 17, Lund
• defense date: 2011-01-14 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86671-53-2
• language: English
• LU publication?: yes
• id: ce18d410-fe32-4363-923d-5ada9ada1e7e (old id 1746288)
• date added to LUP: 2016-04-01 13:42:51
• date last changed: 2019-05-21 23:29:11