bHLH transcription factors in differentiating neuroblastoma cells

Abstract

Neuroblastoma is a tumor of the sympathetic nervous system, and arises during early childhood. The tumor is highly heterogeneous and evidence, such as expression of genes normally only expressed during embryonic and fetal stages, suggests that the tumor is of embryonic origin and that the tumor arises as a consequence of perturbed differentiation during the development of the sympathetic nervous system. Transcription factors implicated in this differentiation program are therefore of potential interest in order to understand the genesis of neuroblastoma. Based on findings in Drosophila, several transcription factors playing vital roles in the development of the vertebrate peripheral nervous system have been identified, some of them belonging to the basic helix-loop-helix (bHLH) family. Amplification of the protooncogene N-Myc is one of the most important genetic aberrations in neuroblastoma. There is a high positive correlation between N-Myc amplification and malignancy, but the molecular consequences of this phenomenon have only been partly investigated. The work presented here describes the roles of the bHLH transcription factors HASH-1, HES-1, and the bHLHZip transcription factors N-Myc, Mad proteins, Mnt/Rox, and Max during neuroblastoma cell differentiation. It suggests that a controlled temporal expression patterns of some of these genes are important in order to allow neuronal differentiation to proceed.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Under fosterutvecklingen är det viktigt att alla kroppens celltyper kommer till rätt plats vid rätt tidpunkt. Det är också viktigt att cellerna mognar och delar sig under kontrollerade former. Då dessa processer inte fungerar, kan missbildningar eller cancer uppstå.



Redan på embryonalt stadium börjar nervsystemet ta form. En del av nervsystemet kallas det autonoma eller självständiga nervsystemet. Det ansvarar för vissa funktioner som inte kan styras av viljan och är av betydelse vid till exempel fara och stress. När celler i det sympatiska nervsystemet, som tillhör det autonoma nervsystemet, utvecklas till tumörceller uppstår tumören neuroblastom. Neuroblastom drabbar ungefär 14 barn om året i Sverige. Eftersom tumörerna kan ha mycket varierande egenskaper och sjukdomen är relativt sällsynt, diagnosticeras och behandlas barnen ofta sent i sjukdomsförloppet. Behandlingen består av, om möjligt, avlägsnande av tumören och cellgifter och/eller strålningsbehandling. Av de barn som får diagnosen neuroblastom överlever ungefär hälften.



Transkriptionsfaktorer är proteiner som kontrollerar genaktivitet. De binder till specifika DNA-sekvenser i anslutning till de genkodande regionerna och kan därmed aktivera eller hämma genuttryck. Jag har studerat vissa bHLH-proteiner som är viktiga för utvecklingen av det sympatiska nervsystemet och också bHLHZip-proteiner, som är viktiga för kontroll av celltillväxt, cellmognad och celldöd. Båda proteintyperna arbetar i par. Proteinparens effekt beror på vilken kombination av proteiner som ingår i komplexen. Med hjälp av "basic" regionen kan de binda till DNA, medan "helix-loop-helix" och "leucine zipper" regionerna utgör kontaktytan mellan proteinerna i proteinparen.



I arbete I studerade vi aktiviteten av generna dHAND och HASH-1, som kodar för bHLH-proteiner som normalt bara uttrycks under embryo- och fosterutvecklingen. Vi visade att alla undersökta neuroblastomtumörer och neuroblastomcellinjer har en aktiv dHAND-gen och ofta också en aktiv HASH-1-gen, vilket tyder på att neuroblastom har ett embryonalt ursprung. Det viktigaste studien visade var dock att uttrycket av dHAND är oberoende av neuroblastomtumörernas aggressivitetsgrad. Därför skulle man potentiellt kunna använda dHAND för att identifiera alla stadier av neuroblastom och en tillämpning av detta fynd skulle kunna leda till att man lättare identifierar neuroblastom hos patienter.



I arbete II har vi undersökt relationen mellan bHLH proteinerna HASH-1 och HES-1 i differentierande (mognande) neuroblastomceller. Eftersom det har visats att neuroblastomceller i många fall har en aktiv HASH-1 gen, undersökte vi hur denna gen regleras i neuroblastomceller. Man har tidigare visat att HES-1 kontrollerar uttrycket av HASH-1 i småcellig lungcancer, och vår studie ledde till identifieringen av en motsvarande mekanism i neuroblastomceller. I dessa celler introducerade vi också ett receptorprotein, kallat Notch1, och visade att Notch1 hämmar differentiering och att detta troligen orsakas av att Notch1 överaktiverar HES-1-genen. Studien demonstrerade att en kortvarig HES-1-aktivitet troligen är ett led i neuronal differentiering, medan en långvarig HES-1 aktivitet motverkar samma process. Det verkar därmed som att HES-1-genen har samma roll i mognande neuroblastomceller som den har under bildandet av nervsystemet.



Proteiners funktion styrs ofta i samverkan med andra proteiner. Arbete III gick ut på att hitta proteiner som binder till HASH-1-proteinet och därmed kanske reglerar HASH-1-proteinets aktivitet och funktion. Vi använde oss av en teknik, kallad jäst två-hybrid, och ett cDNA-bibliotek. cDNA-biblioteket kodar för hela den arsenal av proteiner som kan bildas i en specific cell, i vårt fall neuroblastomceller. Vi använde HASH-1-proteinet som bete för att fiska efter potentiellt interagerande biblioteksderiverade proteiner. Studien visade att HASH-1 binder till bHLH-proteinet E2-2 och att de två proteinerna i samverkan kan aktivera gener. E2-2 verkar dessutom vara HASH-1-proteinets vanligaste förekommande interaktionspartner i neuroblastomceller. I en annan studie, har vi använt HES-1 som bete och fiskat upp Calmodulin, ett protein som man tidigare visat modulerar bHLH-proteiners aktivitet. Interaktionen kommer så småningom att prövas med ytterligare tekniker.



N-Myc är en transkriptionsfaktor som tillhör bHLHZip-proteinfamiljen. Ampifiering och högt uttryck av N-Myc-genen har visat sig vara ett tecken på dålig prognos i neuroblastom. Vi studerade därför ett nätverk av bHLHZip trankriptionsfaktorer där N-Myc, Max och Mad-proteiner ingår och denna studie beskrivs i arbete IV. Vi studerade de motsvarande genernas uttryck och proteinernas DNA-bindande aktivitet i två differentierande neuroblastom-cellinjer, varav den ena hade högt och den andra lågt uttryck av N-Myc. Studien demonstrerade att Mad-generna har ett komplicerat uttrycksmönster som förändras under differentiering. Vi introducerade också Mad-DNA i en neuroblastomcellinje, för att undersöka Mad-genens påverkan på neuroblastomcellers tillväxt och försöken visade att Mad inte hade någon effekt på celltillväxten. Vidare visade studien att uttrycket av N-Myc-genen minskar i differentierande neuroblastomceller och att nedregleringen återspeglas i en minskad DNA-bindande aktivitet. Arbetet visade därmed att balansen i N-Myc/Max/Mad-nätverket påverkas av differentieringsprocessen i neuroblastomceller.

• author: Grynfeld, Anna
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Larsson, Lars-Gunnar, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden
• organization: Division of Molecular Medicine and Gene Therapy
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cancer and Oncology
• keywords: bHLH, Neuroblastoma, HES-1, HASH-1, N-Myc, differentiation, Mad, Medicine (human and vertebrates), Medicin (människa och djur)
• pages: 111 pages
• defense location: "Medelhavet", Wallenberg Laboratory, U-MAS, Malmo
• defense date: 2001-04-20 10:15:00
• ISBN: 91-628-4703-1
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Molecular Medicine (013031200), Division of Molecular Medicine and Gene Therapy (013022010)
• id: 318f435d-eefc-47e7-970b-c09bc582b805 (old id 41461)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:22:03
• date last changed: 2018-11-21 21:10:32