Inducible nitric oxide synthase in experimental urinary tract infection

Abstract

Urinary tract infection (UTI) is among the most common bacterial infections in humans and the majority are caused by Escherichia coli (E. coli). Abundant evidence indicates that nitric oxide (NO) produced by the inducible NO synthase (iNOS) plays an important role in host defense against infection. This thesis examines iNOS expression in experimental UTI models. The rat and pig bladder urothelium did not express eNOS, nNOS or iNOS under normal conditions. iNOS expression in the rat bladder urothelium was, however, observed after systemic LPS treatment. In experimental bacterial UTI in mice, inflammatory cells expressed both iNOS and COX-2, but uroepithelial cells expressed only iNOS and with a later onset than observed in the inflammatory cells. Increased urinary nitrite levels in E. coli-infected mice coincided in time with the observed iNOS positive inflammatory cells. No difference in bacterial clearance or persistence was noted in bladders and kidneys of wild-type and iNOS deficient mice. When the effect of NO/peroxynitrite on bacterial viability was investigated, it was noted that a uropathogenic E. coli strain was less sensitive to NO-mediated killing than an avirulent E. coli strain. Isolated human uroepithelial cells did not express iNOS when exposed to uropathogenic E. coli or LPS. A combination of IL-1b, TNFa and IFNg was required for iNOS induction in human uroepithelial cells. The signaling pathways leading to iNOS induction depend on the activation of tyrosine kinases, JAK/STAT, PKC, p38 MAPK and NF-kB. Cytokines, but not bacteria, caused nuclear translocation and binding of NF-kB to the iNOS promoter. P fimbriated bacteria and sphingomyelinase inhibited cytokine-induced iNOS expression. Oxidative stress induced by H2O2 had more profound effects on cell viability in uroepithelial cells than NO and nitrogen species. In summary, our results demonstrate activation of iNOS in inflammatory and uroepithelial cells as part of the host defense against bacterial UTI. Wild-type and iNOS deficient mice were equally susceptible to E. coli-induced UTI. iNOS expression in uroepithelial cells was induced by cytokines but not bacteria. The failure of E. coli to cause iNOS induction may be related to insufficient translocation and binding of nuclear NF-kB. Both bacteria and uroepithelial cells were relatively resistant to NO-mediated cytotoxicity.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Urinvägsinfektion är en av de vanligaste förekommande bakteriella infektioner hos människa och vid 30 års ålder har var femte kvinna någon gång varit drabbad. 80% av alla urinvägsinfektioner orsakas av bakterien Escherichia coli (E. coli). Urinväginfektion kan ge sig till känna i två former. Vid den vanligaste och inte fullt så allvarliga formen, cystit (blåskatarr), är symptomen lokaliserade till enbart blåsan. Vid den allvarligare formen, pyelonefrit (njurbäckeninflammation), är njurarna påverkade och symptomen oftast systemiska (d.v.s. påverkar hela kroppen). Det inflammatoriska svaret och effekten av den bakteriella infektionen bestäms av bakteriestammens förmåga att orsaka sjukdom (virulensgrad). Bindning av bakterier till blåsans eller njurens epitelceller är ett viktigt steg i infektionsprocessen. När E. coli når urinvägarna binder den till receptorer lokaliserade på urotelcellerna med hjälp av adhererande bakteriella strukturer, s.k. fimbrier. Detta blir signalen för vävnadsförsvaret att aktiveras. Det har visats att vävnadsförsvar mot sjukdomsalstrande (patogena) organismer involverar kväveoxid (NO) vilket genereras av ett enzym som kallas kväveoxidsyntas (NOS). Enzymet NOS finns i två former, en konstitutiv (ständigt) aktiverad Ca2+- beroende form lokaliserad i t.ex. nerver (nNOS) och kärlendotel (eNOS), samt en inducerbar, Ca2+- oberoende form (iNOS), funnen i t.ex. makrofager. Syftet med avhandlingen var att studera enzymet iNOS i experimentella modeller av urinvägsinfektion. I våra studier visar vi att eNOS, nNOS och iNOS inte förekommer normalt i urotelceller från råttblåsa och grisblåsa. iNOS kunde dock induceras i råttans urotelceller efter systemisk behandling med lipopolysackarid (LPS), d.v.s. bakteriella endotoxiner. Vi undersökte även iNOS förekomst efter bakteriell infektion hos mus, d.v.s. då uropatogena bakterier infördes direkt i blåsa. I dessa studier visar vi att inflammatoriska celler i blåsa och njure uttrycker iNOS i ett tidigt skede efter den bakteriella infektionen. Blåsans och njurens urotelceller uttrycker också iNOS men i ett senare infektionsskede. Dessa resultat visar att iNOS är en del av vävnadssvaret vid bakteriell urinvägsinfektion och att såväl inflammatoriska celler som urotelceller uttrycker iNOS. Genom att använda möss som inte kan bilda enzymet iNOS (iNOS-/- möss) undersöktes om NO har betydelse i vävnadsförsvaret mot uropatogena bakterier. Vi fann att den bakteriella koloniseringen av blåsa och njure var oberoende av iNOS. När syre reagerar med NO bildas en molekyl (peroxynitrit) som är giftigare än NO. Eftersom våra resultat tyder på att bakterieantalet i blåsa och njure inte påverkas av iNOS och NO undersökte vi om E. coli var känslig för NO/peroxynitrit. Resultaten visar att patogena E. coli stammar är mindre känsliga för NO/peroxynitrit än ickepatogena E. coli stammar. Detta kan bero på att patogena stammar av E. coli har utvecklat mekanismer för att skydda sig mot värdvävnadens produktion av bakteriedödande NO/peroxynitrit. NO påverkar inte enbart bakterier och andra infekterande organismer utan kan även vid hög och okontrollerad produktion, som vid en infektion, skada de kroppsegna cellerna. Då vi undersökte NO/peroxynitritens effekt på urotelceller från människa fann vi emellertid att urotelcellerna är förhållandevis okänsliga mot NO/peroxynitrit. För att studera iNOS uttryck på cellulär och molekylär nivå användes isolerade odlade urotelceller från människa. Stimulering med cytokiner (IL-1b, TNFa och IFNg), men inte bakterier, leder till iNOS uttryck i humana urotelceller. Då olika signaleringsvägar undersöktes visade det sig att cytokiner, men inte bakterier, leder till aktivering av transkriptionsfaktorn NF-kB. Inhibering av NF-kB visade att NF-kB är nödvändig för att iNOS skall bildas. Vidare fann vi att signaleringsproteiner så som tyrosin kinaser, PKC och p38 MAPK är involverade i aktivering av iNOS. Ett intressant fynd var att bakterier kunde hindra att cytokinerna aktiverar iNOS.

• author: Poljakovic, Mirjana
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Wiklund, Peter, Stockholm
• organization: Division of Clinical Chemistry and Pharmacology
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Pharmacology and Toxicology; Medicinal Chemistry
• keywords: Urology, host defense, cell viability, nitrate, lipopolysaccaride, cytokines, sphingomyelinase, mitogen activator protein kinase, nitric oxide, nitrotyrosine, E. coli, cyclooxygenase, urinary tract infection, prostaglandins, urothelium, bladder, kidney, NADPH diaphorase histochemistry, nitric oxide synthase, vävnadskultur, histokemi, cytokemi, Histologi, tissue culture, histochemistry, cytochemistry, Histology, nefrologi, Urologi, nephrology, Infections, Infektioner
• pages: 176 pages
• defense location: F-sal 1, Central Building, Lund University Hospital
• defense date: 2002-05-18 09:00:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECF - 1049
• ISBN: 91-628-5226-4
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Persson K., Poljakovic M., Johansson K. and Larsson B. Morphological and biochemical investigation of nitric oxide synthase and related enzymes in the rat and pig urothelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 47:739-749, 1999. Article: II. Poljakovic M., Svensson M-L., Svanborg C., Johansson K., Larsson B. and Persson K. Escherichia coli-induced inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase expression in the mouse bladder and kidney. Kidney International 59:893-904, 2001. Article: III. Poljakovic M., Karpman D., Svanborg C. and Persson K. Human renal epithelial cells express iNOS in response to cytokines but not bacteria. Kidney International 61:444-455, 2002. Article: IV. Poljakovic M. and Persson K. Urinary tract infection in iNOS deficient mice with focus on bacterial sensitivity to nitric oxide. (Submitted). Article: V. Poljakovic M., Nygren J.M. and Persson K. Stimulatory and inhibitory pathways regulating iNOS expression in human kidney epithelial cells. (Manuscript).
• id: 4f47d1c9-2189-442d-aa65-e5fcf150595e (old id 464659)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:35:42
• date last changed: 2018-11-21 20:59:39