Structural and functional studies of factor V in health and disease

Abstract

The homologous blood coagulation factors V (FV) and factor VIII (FVIII) are important at sites of vascular injury for the amplification of the clotting cascade. Activated FV (FVa) serves as a cofactor to the enzyme activated factor X (FXa) in the activation of prothrombin. This complex is called the prothrombinase complex. FVIII functions as a cofactor to the enzyme activated factor IX (FIXa) in the activation of factor X (FX), a complex referred to as the tenase complex. To prevent uncontrolled coagulation, the anticoagulant protein C system inactivates the cofactors FV and FVIII. Recently, it was shown that FV possesses anticoagulant properties in addition to its procoagulant function, by serving as a cofactor to the enzyme activated protein C (APC) in the down regulation of FVIIIa. As FV has a dual role in coagulation, being important in both procoagulant- and anticoagulant systems, disorders of the FV molecule can cause both bleeding tendencies and hypercoagulable states. The research presented in this thesis is based on structural and functional studies of FV under both normal and pathological conditions. The first papers (papers I-V) deal with the formation and down regulation of the prothrombinase complex, with special reference to the FVa:FXa interaction. We show that the FV activation is associated with a stepwise release of the B domain, which results in a gradual exposure of the FXa-binding site. The FXa-binding site on FVa was then outlined by targeted glycosylation to probe molecular regions involved in the FVa-FXa interaction. The FVa:FXa interaction was further defined by replacing potentially interesting residues with alanines. The last papers (papers VI-VII) focus on the elucidation of the molecular mechanisms behind two naturally occurring mutations of FV; FV New Brunswick and FV Liverpool. We show that the New Brunswick FV variant is associated with reduced stability. This finding might explain the bleeding disorder of the affected patients. The FV Liverpool mutation induces an extra sugar group in FV that appears to interfere with the two anticoagulant proteins APC and protein S. These observations can well explain the association of the Liverpool mutation with thrombosis. In the background of the thesis the biochemistry and biology of FV is described in parallel with that of FVIII as the cofactors are highly homologous both structurally and functionally.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

När folk frågat mig vad det är egentligen jag håller på med på labbet, brukar jag lite slarvigt svara att jag jobbar med blod. Jag tänkte här lite närmare gå igenom vad det är jag egentligen gjorde på labbet för Er som undrat. Jag har studerat ett protein i blodkoagulationen som heter faktor V (läs 5). För att man ska förstå varför detta protein är viktigt, måste man nog känna till lite om hur blodet är uppbyggt och fungerar. Blodet är fiffigt sammansatt. I flytande form fungerar det som en transportör och tillgodoser kroppens celler med syre och näringsämnen och för bort cellernas avfallsprodukter. Blodet övergår i fast form då en skada uppstår, för att hindra blödningsförluster och påbörja läkningsprocessen. Obalansen mellan blodets flytande och fasta form gör att olika sjukdomar uppstår såsom blödarsjuka och blodpropp. Blödarsjuka är ovanligare, medan blodpropp tillhör en av de största folksjukdomarna och kan leda till både stroke och hjärtinfarkt.



Blodkoagulationen består av en massa proteiner. Det finns två olika sorters proteiner i koagulationssystemet: enzymer och proteiner som assisterar enzymerna, kallade kofaktorer. Proteinerna cirkulerar i blodet i ett inaktivt förstadium, vilket är viktigt för att inte blodet ska koagulera utan kunna cirkulera i sin flytande form. Blodkoagulationen triggas när en skada uppstår på ett kärl. Detta gör att en massa reaktioner sätts igång och att icke-aktiverade proteiner aktiveras; dessa kan i sin tur aktivera andra proteiner och så vidare. Det hela arrangemanget kan liknas vid en kaskad. Enzymer fungerar som katalysatorer och klyver icke-aktiverade proteiner så att de blir aktiva. Kofaktorerna assisterar enzymerna och gör att de blir effektivare. Den stegvisa aktiveringen gör att den slutliga signalen blir kraftigt förstärkt. I sista steget i koagulationen bildas enzymet trombin som klyver fibrinogen så att ett nät av fibrin kan bildas. I detta nät fastnar sen blodplättar, vilket gör att blodet stelnar. För att inte blodet ska koagulera okontrollerat och blodproppar ska uppstå, är det viktigt att reglera processen. Detta görs av antikoagulationen. Man kan likna kampen mellan de två systemen koagulationen och antikoagulationen vid ett schackspel där de två systemen tävlar med hjälp av sina pjäser, proteinerna, om blodets öde. I denna maktkamp spelar faktor V och faktor VIII en avgörande roll. Aktiverat protein C (APC), det centrala enzymet i antikoagulationen, inaktiverar faktor V och faktor VIII. Trombin, koagulationens viktigaste protein, aktiverar istället faktor V och faktor VIII. Balansen mellan aktivering och inaktivering av faktor V och faktor VIII är avgörande för om blodet ska stelna eller flyta.



Faktor V har en dubbel funktion och är viktigt för både koagulationen och antikoagulationen. I koagulationen fungerar faktor V som en kofaktor till enzymet FXa i aktiveringen av protrombin till trombin. Denna ”prokoagulanta” aktivitet nedregleras av APC. Dessutom har faktor V ”antikoagulant” aktivitet genom att fungera som en kofaktor, tillsammans med protein S, till APC i nedbrytningen av faktor VIII. På grund av denna dubbla funktion kan rubbningar i faktor V molekylen göra att både blödning och blodpropp kan uppstå. Blödningsrubbningar orsakat av defekter i faktor V är ovanligt. Desto vanligare är rubbingar i faktor V som gör att blodpropp uppstår. Detta är en relativt ny upptäckt som gjorts i Malmö av Björn Dahlbäck. Rubbningen kallas för APC resistens och innebär att APC inte kan nedreglera den ”prokoagulanta” aktiviteten av faktor V. APC resistens är idag den vanligaste ärftliga orsaken till blodproppar i benen och lungorna och uppskattas förekomma hos 5-15% av den svenska befolkningen.



Jag har i mitt avhandlingsarbete studerat faktor V molekylens struktur och funktion. För att kunna studera detta har jag använt mig av rekombinant teknologi. Genom denna teknik kan man förändra faktor V-genen med hjälp av molekylärbiologiska metoder för att sen infektera celler med det. Cellerna uttrycker sedan modifierade proteiner. På så sätt har jag skapat olika faktor V-varianter, och analyserat deras respektive funktion med olika metoder.



Mitt avhandlingsarbete kan delas in i två delar. I den första delen, uppsats I-V, har syftet varit att studera hur faktor V fungerar som kofaktor till enzymet faktor Xa. Jag har försökt kartlägga hur dessa två proteiner binder varandra med hjälp av olika tekniker och tillvägagångssätt. I det första delarbetet (I) använde vi oss av faktor V-varianter där de tre aktiveringsställena för trombin hade eliminerats genom att ersätta dem med andra aminosyror. På så sätt kan man studera betydelse av de olika aktiveringsställena för att faktor Xa ska kunna binda in. Som tidigare nämnts cirkulerar faktor V i ett inaktivt förstadium, och det är först då det aktiveras, som bindningsstället för faktor Xa exponeras. I den andra uppsatsen (II) uttryckte vi faktor V-varianter med extra sockermolekyler. Tanken var att genom att sätta dit sockermolekyler på olika ställen, kunna hämma faktor Xa från att binda in. På så sätt kunde vi studera vilka områden på faktor V som är viktiga för att faktor Xa ska binda in. I delarbete III försökte vi definiera faktor Xa-bindningsstället i mer detalj, genom att uttrycka en mängd faktor V-varianter med potentiellt intressanta aminosyror utbytta mot aminosyran alanin. I uppsatserna IV och V studerade vi hur faktor Xa bindningsstället nedregleras av de antikoagulanta proteinerna APC och protein S.



I den andra delen, uppsats VI-VII, har syftet varit att studera faktor V-varianter från patienter med ärftliga defekter, så kallade mutationer, i faktor V molekylen. Detta för att förstå varför mutationerna påverkar funktionen av faktor V och orsakar sjukdom hos patienterna. Eftersom att faktor V är viktigt både för koagulationen och antikoagulationen kan rubbningar i faktor V molekylen både orsaka blödning och blodpropp. I uppsats VI tittade jag på en mutation kallad faktor V New Brunswick. Denna faktor V-variant är kopplad till blödningsproblem. För att förstå varför mutationen orsakar sjukdom uttrycktes den och dess funktion karaktiserades. Analyserna visade att denna faktor V-variant är mindre stabil vilket gör att den snabbare förlorar sin funktion. Denna upptäckt kan sannolikt förklara varför patienterna uppvisar blödningsproblem. I den sista uppsatsen (VII) studerades en faktor V-variant från två bröder från Liverpool med svåra problem med blodproppar. DNA-analyser av brödernas faktor V-gen visade att den ena genen inte uttrycktes, och att den andra innehöll en mutation som gör att faktor V-proteinet uttrycks med en extra sockermolekyl. Vi uttryckte faktor V-varianten med den extra sockermolekylen och studerade hur den interagerade med andra proteiner. Vi fann att inaktiveringen av faktor V-varianten med APC var försämrad. Vidare såg vi även att dess förmåga att fungera som kofaktor till APC var försvagad. Dessa upptäckter förklarar varför bröderna haft problem med blodproppar.

• author: Steen, Mårten
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Voorberg, Jan
• organization: Clinical Chemistry, Malmö (research group)
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry
• keywords: Klinisk kemi, Clinical chemistry, APC resistance and hemophilia, thrombosis, factor VIII, coagulation, factor V
• pages: 132 pages
• defense location: Jubileumsaulan kl 09.15 i Malmö
• defense date: 2003-09-12 10:15:00
• ISBN: 91-628-5779-7
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Steen M. and Dahlback B. (2002) Thrombin-mediated proteolysis of factor V resulting in gradual B domain release and exposure of the factor Xa-binding site. J Biol Chem 277: 38424-38430. Article: II. Steen M., Villoutreix B. O., Norstrom E. A., Yamazaki T. and Dahlback B. (2002) Defining the Factor Xa-binding Site on Factor Va by Site-directed Glycosylation. J Biol Chem 277: 50022-50029. Article: III. Steen M., Villoutreix B. O., Tholander A. and Dahlback B. (2003) Mapping the Factor Xa-binding Site on Factor Va by alanine scanning mutagenesis. Manuscript. Article: IV. Steen M., Blom A. M., Norstrom E. A. and Dahlback B. (2003) Binding site for factor Xa involving residues 666-686 in factor Va – activated protein C mediated cleavage at Arg679 down regulates factor Xa affinity. Manuscript. Article: V. Norstrom E. A., Steen M. and Dahlback B. (2003) Effects of factor Xa and proteins S on the individual activated protein C-mediated cleavages of factor Va. Manuscript. Article: VI. Steen, M., Miteva M., Villoutreix B. O., Yamazaki T. and Dahlback, B. (2003) Factor V New Brunswick: Ala221Val associated with FV deficiency reproduced in vitro and functionally characterized. Blood 102: 1316-1322. Article: VII. Steen M., Norstrom, E. A., Bolton-Maggs P.H.B., Mumford A., McVey J.H., Tuddenham E.G.D. and Dahlback B. (2003) Functional characterization of factor V Liverpool: Ile359Thr a novel mutation associated with thrombosis. Submitted to Blood.
• id: 597c7ada-ccd0-4bd6-a77b-32f9a25a7577 (old id 466026)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:31:11
• date last changed: 2018-11-21 21:05:22