Regulation of exocytosis by Ca2+ and cAMP - A study on pancreatic beta- and alpha-cells

Abstract

Type-2 diabetes is characterized by impaired insulin secretion associated with excess glucagon release. Exocytosis of insulin- or glucagon-containing granules is initiated by Ca2+-influx through voltage-dependent Ca2+-channels and is modulated by the second messengers such as cAMP. Membrane capacitance measurements were used in this study to investigate the cellular mechanisms behind cAMP-regulated Ca2+-dependent exocytosis in pancreatic beta-and alpha-cells. In pancreatic beta-cells, the secretory granules have been demonstrated to co-localize with L-type Ca2+-channels. Experiments using photorelease of caged Ca2+ revealed that exocytosis of insulin-containing granules requires an increase in [Ca2+]i with a Kd of 17 µM, which is most likely achieved in the vicinity of the Ca2+-channels. It was further proved that a close association between the alpha1c L-type Ca2+-channels and the secretory granules is a prerequisite for rapid exocytosis and ensures maximum usage of Ca2+ influx in a cell with few Ca2+-channels (~500) as is the case in the beta-cell. Pharmacologically, L-type Ca2+-channels are suppressed by organic Ca2+-channel blockers such as dihydropyridines. Glacontryphan- M was isolated from the venom of Conus Marmoreus and was detected to reduce L-type Ca2+ currents and associated exocytosis. It was discovered that this novel antagonist needs the binding of Ca2+ to the Gla-residues for its function. Ca2+-dependent exocytosis in the beta-cell is enhanced by cAMP through both PKA-independent granular priming and PKA-dependent recruitment of granules from a reserve pool. This study revealed a concentration-dependent activation of the two cAMP-signalling pathways and that 5-fold higher [cAMP]i was needed for the PKA-independent mechanism. Interestingly, the sulfonylurea receptor SUR1 was required in the regulation of cAMP-stimulated PKA-independent exocytosis. This is an additional function of SUR1 apart from being a subunit of the KATP channel. Enhancement of exocytosis by cAMP in alpha-cells was discovered to involve similar mechanisms as in the beta-cell. In the present study glucagon was detected to elevate cAMP resulting in an enhanced Ca2+-dependent exocytotic response by binding to the glucagon-receptors in the plasma membrane of the alpha-cell. The stimulatory effect of glucagon was mainly mediated by PKA-dependent mechanisms, possibly due to the inability of glucagon to elevate [cAMP]i to the sufficient level needed for activation of the PKA-independent pathway.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Glukos är den främsta energikällan för de flesta celler i kroppen. Det är av stor vikt att mängden glukos hålls på en jämn nivå, eftersom framförallt våra celler i hjärnan är mycket känsliga för stora variationer av glukoshalten i blodet. Regleringen av mängden glukos i blodet kontrolleras av hormonen insulin och glukagon. Insulin utsöndras från beta-celler och glukagon från alpha-celler, båda belägna i bukspottkörtels Langerhanska öar. Insulin sänker glukoshalten i blodet efter en måltid medan glukagon höjer glukoshalten då kroppen behöver tillskott av energi såsom då vi motionerar eller är under stress. Patienter med åldersdiabetes eller typ-2 diabetes har ofta en försämrad utsöndring av insulin samtidigt med en ökad sekretion av glukagon. Det vill säga kontrollen av mängden glukos i blodet är satt ur funktion. Normalt sker insulinsekretion i två faser, en första snabb fas som pågår 5-10 min följt av en långsam mer kontinuerlig fas. Patienter med åldersdiabetes saknar den första snabba fasen och den andra fasen är något reducerad. Insulin och glukagon befinner sig i små blåsor (granula) inne i repektive cell. Dessa blåsor smälter samman (fuserar) med cellens membran vid en given signal och innehållet kan komma ut i blodet. Signalen som initierar utsöndringen är ett ökat inflöde av kalcium-joner (Ca2+) genom speciella spänningskänsliga, vattenfyllda kanaler (jonkanaler) i cellens membran. Utsöndringen av hormonen kan vidare påverkas av andra substanser, ett sådan substans är cykliskt AMP (cAMP). Ett nytt läkemedel mot typ-2 diabetes som är under prövning, GLP-1, verkar bl.a. genom att öka cAMP-koncentrationen inne i cellen. I denna avhandling har de cellulära mekanismer varmed cAMP och Ca2+ påverkar utsöndringen av insulin och glukagon undersökts. Fusionen av granula med plasmamembran och därmed utsödringen av insulin (eller glukagon) har studerats på enskilda celler med en speciell teknik som kallas kapacitansmätningar. Denna teknik bygger på principen att cellens membran elektriskt kan likställas med en plattkondensator. Vidare gäller att då ytan på en kondensator ökar så ökar dess kapacitans. Detta kan utnyttjas eftersom när ett granula smälter samman med cellens membran ökar dess yta och även dess kapacitans. Det första delarbetet behandlar kopplingen mellan inflöde av Ca2+ och insulingranula. För att granula ska kunna fusera med cellmembranet krävs en hög koncentration av kalcium, mycket högre än medelkoncentrationen inuti cellen. Cellen löser detta genom att Ca2+-kanalen binder samman med insulingranula vid cellmembranet. På detta vis sker fusionen av granula snabbt samtidigt som energiåtgången för att återställa Ca2+-koncentrationen till sin vilonivå inne i cellen minimeras. I det andra delarbetet har en ny substans som utvunnits från en vattenlevande snigel, Conus Marmoreus, undersökts. Normalt är denna substans en del av snigelns gift, som används för att paralysera och fånga byten. Det visade sig att substansen blockerade de speciella Ca2+-kanaler som finns i beta-cellen. Substansen kan utnyttjas för att studera Ca2+-kanalens betydelse i olika system inte bara vid insulinsekretion. Vidare har betydelsen av cAMP för en ökad utsöndring av insulin studerats. Våra undersökningar visade på att cAMP stimulerar insulinsekretion både genom att aktivera ett protein som heter proteinkinas A (PKA) och genom att binda till ett annat protein, cAMP-GEFII. Proteinkinas A medverkar till att påskynda förflyttningen av insulingranula till cellens membran och påverkar framförallt den andra fasens insulinsekretion. Genom att binda till cAMP-GEFII stimulerar cAMP framförallt den snabba utsöndringen av insulin under den första fasen. Ett av de intressanta fynden i detta arbete berör den receptor, till vilken de antidiabetiska medicinerna sulfonylureas binder in på cellens membran. Genom att binda till denna receptor startas en kaskad som leder till utsöndring av insulin. Detta abete har visat att denna receptor också har en viktig funktion i ett av de avslutande stegen innan de insulininnehållande granula kan fusera med cellmembranet. Avslutningsvis behandlas alpha-cellen som utsöndrar glukagon. Det visade sig att cAMP förmår påverka glukagonsekretion på ett liknade sätt som i beta-cellen samt att glukagon har förmågan att stimulera sin egen sekretion åtminstone på enskilda celler. De mekanismer som har undersökts i denna avhandling påverkar framförallt första fasens insulinsekretion som saknas hos patienter med typ-2 diabetes. Dessa undersökningar är därför av stor betydelse för att förstå uppkomsten av denna sjukdom samt för att finna nya och bättre läkemedel.

• author: Ma, Xiaosong
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Gylfe, Erik, Uppsala University
• organization: Department of Experimental Medical Science
• publishing date: 2004
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Developmental Biology
• keywords: Endocrinology, secreting systems, type-2 diabetes, SUR1, Ca2+-channel, glucagon, exocytosis, insulin, diabetology, Endokrinologi, sekretion, diabetologi
• pages: 113 pages
• defense location: Segerfalkssalen, BMC, Sölvegatan 19
• defense date: 2004-10-29 10:15:00
• ISBN: 91-628-6259-6
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Sebastian Barg, Xiaosong Ma, Lena Eliasson, Juris Galvanovskis, Sven O.Göpel, Stefanie Obermüller, Josef Platzer, Erik Renström, Michel Trus, Daphne Atlas, Jörg Striessnig and Patrik Rorsman (2001). Fast exocytosis with few Ca2+ channels in insulin-secreting mouse pancreatic B cells. Biophys J 81: 3308-3323 Article: II. Karin Hansson, Xiaosong Ma, Lena Eliasson, Eva Czerwiec, Bruce Furie, Barbara C. Furie, Patrik Rorsman and Johan Stenflo (2004). The first γ-carboxyglutamic acid-containing contryphan: A selective L-type calcium ion channel blocker isolated from the venom of conus marmoreus. J Biol Chem 279: 32453-32463 Article: III. Lena Eliasson*, Xiaosong Ma*, Erik Renström*, Sebastian Barg, Per-Olof Berggren, Juris Galvanovskis, Jesper Gromada, Xingjun Jing, Ingmar Lundquist, Albert Salehi, Sabine Sewing and Patrik Rorsman (2003). SUR1 regulates PKA-independent cAMP-induced granule priming in mouse pancreatic B-cells. J Gen Physiol 121: 181-197 Article: IV. Xiaosong Ma, Yang Zhang, Jesper Gromada, Sabine Sewing, Per-Olof Berggren, Karsten Buschard, Albert Salehi, Jenny Vikman, Patrik Rorsman and Lena Eliasson (2004). Glucagon stimulates exocytosis in mouse and rat pancreatic alpha cells by binding to glucagon receptors. Mol Endocrinol, in press
• id: 3168518a-1355-4731-a9df-1301967f2bc9 (old id 467407)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:23:14
• date last changed: 2018-11-21 21:10:39