Cyclin E overexpression and associated events in human breast cancer

Abstract

Unrestrained proliferation is a hallmark of cancer and genetic defects within G1/S-phase regulation and the pRb pathway occur frequently. Proliferation control can be circumvented either by excess cyclin D1 or cyclin E, alterations that can define two alternative tumour biologic pathways in breast cancer. By overexpressing cyclin E in a cell line model system we demonstrate that the capacity of cells to normalize the level of active cyclin E/cdk2 was dependent on the ability to upregulate and re-direct p21 and p27 to the active kinase complex, as could be observed in ER positive and cyclin D1 high, but not the ER negative and cyclin E high cell lines. The results further indicated that cyclin E and associated kinase activities might regulate proliferation independent of pRb. One alternative substrate for cyclin E kinase is the ID2 protein. Upon ID2 overexpression, the proliferative capacity increased but the invasive potential of breast cancer cell lines decreased. In primary breast cancer, high ID2 expression was associated with a favourable outcome and a less aggressive and more differentiated luminal breast cancer phenotype. Next we evaluated the incidence of aberrant cyclin E expression in the S/G2/M-phases, and investigated the potential tumour biologic characteristics associated with impaired cyclin E degradation. Cyclin E overexpressing breast cancer cells lines displayed varying ability to degrade excess cyclin E, and exhibited prolonged S-phase progression. Tumours with aberrant cell cycle specific expression pattern of cyclin E correlated inversely with survival status of patients and there was a favour for c-myc amplification within this group of tumours. We further characterised potential novel functions of cyclin E, and breast cancer cell lines overexpressing cyclin E induced significant changes in gene expression related to cell adhesion. Cells further showed an impaired capacity to migrate and invade through ECM. In primary breast cancer we observed a positive correlation between cyclin E expression and tumours with a pushing growth pattern and a medullary breast cancer type, clearly validating the cell line observations. Due to the link between cyclin E and growth pattern, as well as survival, cyclin E expression was consequently associated with impaired prognosis exclusively in patients with breast cancer with an infiltrative growth pattern. Thus, the effects of cyclin E expression and breast cancer progression are multiple, including altered proliferation as well as tumour growth pattern.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Bröstcancer är den vanligast förekommande cancerformen hos kvinnor och årligen drabbas ungefär 6000 kvinnor i Sverige. I de flesta fall uppstår bröstcancer spontant, men viss ärftlighet ligger bakom ca 10 % fallen. Det finns kopplingar till faktorer som ökar risken för bröstcancer. Till riskfaktorer hör bl.a. långvarig exponering för hormoner: tidig mens och sent klimakterie, bruk av p-piller eller östrogena preparat efter klimakterie. Trots att incidensen för bröstcancer har ökat under de senare åren har överlevnaden förbättrats väsentligt. Detta beror troligen på tidigare diagnos och förbättrad behandling.



I de flesta fall är bröstcancer s.k. adenocarcinom, d.v.s. cancer som uppstått i körtelvävnad i bröstet. Körtlar och körtelgångar är uppbyggda av två lager av epitelceller, luminala och myoepiteliala epitelceller. Myoepiteliala celler kan utsöndra proteiner vilka bygger upp ett s.k. basalmembran som omger epitelcellerna. Cancerceller som tillväxer inneslutna av ett basalmembran kallas carcinom in situ och är inte invasiva. En invasiv cancer har förmåga att bryta ned basalmembranet och invadera omgivande vävnad och kan, om de finner väg till lymfkärl och blodbanor, avsätta metastaser i andra delar av kroppen.



Den vanligaste initiala behandlingsformen för bröstcancer är kirurgi och i samband med bröstbevarande kirurgi ges även efterföljande strålbehandling. När tumören avlägsnats bedöms bland annat om den är invasiv eller om den växer in situ. Är tumören invasiv fastställs genom ett antal prognostiska och prediktiva faktorer bl.a. tumörens typ, histologiska grad samt stadium, detta för att kunna förutse tumörens progression och därmed lättare bestämma behandlingsstrategi. Det är vanligt att tumörer uttrycker s.k. östrogenreceptorer (ER) och är beroende av östrogen för sin tillväxt. I dessa fall kan tumören behandlas med hjälp av tamoxifen (TAM), en s.k. östrogenantagonist vilken genom att binda in till östrogenreceptorn blockerar dess positiva aktivitet på tumörtillväxt. Denna behandlingsmetod har i kliniska studier visat sig kraftigt reducera risken för återfall av bröstcancer. Tyvärr finns det tumörer som inte svarar på behandling med tamoxifen. Detta kan bero på att tumörcellerna förlorat sitt receptoruttryck eller att de blivit resistenta mot behandling. Kemoterapi kan i dessa fall vara avgörande för att begränsa tumörens progression.



Bröstcancer har ett mycket variabelt kliniskt förlopp där vissa patienter snabbt utvecklar metastaserande sjukdom med dålig prognos, medan andra inte utvecklar generell sjukdom. Vi vet idag inte orsakerna till skillnaderna, men det är troligt att typ av genetiska skador i tumörerna speglar det kliniska förloppet. Celldelning är den process där en cell duplicerar sin arvsmassa för att generera två exakt likadana dotterceller. Det är en normal process som är viktig när kroppen behöver byta ut döda mot nya eller för kontinuerlig tillväxt, av t.ex. blodkroppar. För att en cell ska dela sig krävs att den stimuleras med tillväxtfaktorer. Normal brösttillväxt som sker kontinuerligt i fas med menscykeln eller vid graviditet, regleras t.ex. med hjälp av hormonerna östrogen och progesteron. Vägen mot celldelning är rigoröst kontrollerad och går genom olika faser i den s.k. cellcykeln. Cellcykelreglerare är involverade i för cellen viktiga funktioner och är potentiella onk- och suppressor-gen produkter. En central del i cancer är tumörcellernas förmåga att dela sig och tillväxa okontrollerat, och en viktig kontrollpunkt i cellcykeln som ofta är defekt i cancer är G1/S-övergången. Cellcykelreglering kan ske på många olika sätt och cykliner och cyklinberoende kinaser (cdk) spelar en avgörande roll. Cykliner och cyklinberoende kinaser bildar tillsammans ett aktivt proteinkomplex vilket kan fosforylera målproteiner och på så sätt aktivera eller inaktivera dessa. Överuttryck av cyklin E är vanligt förekommande i bröstcancer och har kopplats till tumöraggressivitet och dålig prognos.



Syftet med denna avhandling har varit att karakterisera genetiska defekter förknippade till cellcykelkontroll i bröstcancer, med tyngdpunkt på cyklin E och associerad kinasaktivitet. Vi har visat att kontroll av celltillväxt kan kringgås genom förhöjt uttryck av antingen cyklin E eller cyklin D1 och att dessa kan definiera två olika typer av brösttumörer. Cyklin D1 höga tumörer var generellt ER positiva, uttryckte normala nivåer av p27 och funktionellt p53, och tillväxte genom en normal Rb-kontrollerad celldelning. Cyklin E höga tumörer däremot var generellt ER negativa, uttryckte låga nivåer av p27 och var p53 inaktiverade. Vi kunde också påvisa att cyklin E höga tumörer tillväxte oberoende av funktionellt pRb. Genom att överuttrycka cyklin E i odlade brösttumörceller kunde vi visa att cyklin D1 höga tumörer har förmåga att buffra ett högt cyklin E uttryck med hjälp av cdk-inhibitorerna p21 och p27, medan cyklin E höga tumörer saknade denna förmåga och kan därför utvecklas till en mer aggressiv tumörtyp.



Vidare har vi också undersökt det cellcykelspecifika uttrycket av cyklin E i bröstcancer. Cyklin E uttrycks normalt i sen G1-fas och tidig S-fas och är en viktig del i regleringen av initiering av DNA syntes. Ett felaktigt uttryck av cyklin E kan antigen uppstå som förhöjda nivåer av proteinet i G1/S-övergången eller så kan uttrycket kvardröja in i efterföljande cellcykelfaser. Vi kunde påvisa en defekt nedbrytning av cyklin E i brösttumörer samt att patienter med dessa tumörer hade en något försämrad prognos. Genom att överuttrycka cyklin E i odlade brösttumörceller påverkades cellernas förmåga att passera genom S-fasen i cellcykeln. Detta skulle potentiellt kunna leda till att göra cellen mer mottaglig för genetiska förändringar.



Tumörutveckling drivs av cellerna ackumulerar genetiska förändringar i signalvägar som bl.a. styr cellernas tillväxthastighet, men också deras förmåga att inducera celldöd och deras förmåga att förflytta sig i vävnader. Eftersom att olika signalvägar kan interagera med varandra, är det möjligt att olika cellulära processer är sammankopplade med varandra. Därför ville vi undersöka om cyklin E kunde påverka andra processer som är viktiga för tumörutveckling förutom celltillväxt. Genom att överuttrycka cyklin E i odlade brösttumörceller kunde vi påverka cellerna till att bli mindre rörliga. Detta skulle potentiellt kunna inverka negativt på tumörcellernas förmåga att sprida sig i vävnad. Genom att studera brösttumörers olika växtsätt kunde vi dra slutsatsen att cyklin E uttrycktes i större grad i tumörer som växte med väldefinierad avgränsning mot omgivande bröstvävnad till skillnad från tumörer med ett mer spritt växtsätt. Intressant var att cyklin E höga tumörer var associerade till en bättre prognos och de var mindre benägna att sätta metastaser, trots att de generellt var klassade som en mycket aggressiv tumörtyp med hög tillväxthastighet. Trots att cyklin E är kopplat till tumöraggressivitet verkar cyklin E också spela en viktig roll i att begränsa tumörernas spridningskapacitet vilket tyder på ett komplicerat samspel mellan cyklin E uttryck och tumörprogression.



Till sist ville vi undersöka uttrycket av den dominant negativa transkriptionsfaktorn ID2 vars aktivitet regleras med fosforylering av cdk2. Tidigare arbeten har antytt att ID2 har en positiv påverkan på celltillväxt och kan vara kopplat till tumörutveckling. Genom att studera uttrycket av ID2 i en panel av brösttumörer kunde vi dock dra slutsatsen att höga nivåer av ID2 var kopplat till en bättre patientprognos. Dessa tumörer var av s.k. luminal typ, uttryckte ER och var mindre benägna att sätta metastaser. I odlade brösttumörceller med överuttryck av ID2 kunde vi påvisa att ID2 positivt påverkade cellernas tillväxtkapacitet, men att dessa blev mindre benägna att invadera vilket stödjer fynden i bröstcancermaterialet.



Genom årens lopp har det ansamlats en mängd forskningsresultat kring cyklin E och dess betydelse för cancer. Föga oväntad är den bild som växer fram komplex, och nya fynd görs ständigt som ytterligare bidrar med tumörbiologiskt relevanta processer vilka kan påverkas av cyklin E. Genom fortsatt forskning för att ytterligare karakterisera nya typer av bröstcancer hoppas vi att det i framtiden blir möjligt att sätta in en förbättrad målstyrd behandling som kan generera, inte bara ökad livslängd, men också förbättrad livskvalitet för patienter med bröstcancer.

• author: Stighall, Maria
• supervisor: Göran Landberg; Håkan Axelson
• opponent: Docent Grandér, Dan, Karolinska Institute, Sweden
• organization: Pathology, Malmö (research group)
• publishing date: 2005
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cancer and Oncology; Cell and Molecular Biology
• keywords: patologisk anatomi, Patologi (allmän), pathological anatomy, General pathology, tumour growth pattern, invasion, proliferation, ID2, cyclin E, pRb, cell cycle, breast cancer
• pages: 139 pages
• defense location: Main lecture hall, Pathology building, entrance 78, Malmö University Hospital, Malmö
• defense date: 2005-05-28 10:00:00
• ISBN: 91-85439-43-6
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: M Stighall, F Erlandsson, A Bjartell, A Zetterberg and G Landberg. . Aberrant cell cycle expression of cyclin E protein in primary breast cancer. (submitted); P Berglund, M Stighall, K Jirström, S Borgquist, A Sjölander, I Hedenfalk and G Landberg. . Cyclin E overexpression obstructs infiltrative behaviour in breast cancer: a novel function reflected in the growth pattern of medullary breast cancers. (submitted); M Stighall, P Berglund, K Jirström, L Rydén, M Fernö, B Nordenskjöld and G Landberg. . Cyclin E confers a prognostic value exclusively in the subgroup of breast cancer with an infiltrative growth pattern and is not a predictive marker for tamoxifen response in premenopausal breast cancer. (submitted); M Loden, M Stighall, NH Nielsen, G Roos, SO Emdin, H Ostlund and G Landberg. 2002. The cyclin E and cyclin D1 high subgroups of breast cancer: two separate pathways in tumorogenesis based on pattern of genetic aberrations and inactivation of the pRb node. Oncogene, vol 21 pp 4680-90.; M Stighall, C Manetopoulos, H Axelson and G Landberg. 2005. High ID2 protein expression correlates with a favourable prognosis in patients with primary breast cancer and reduce cellular invasiveness of breast cancer cells. Int J Cancer, vol 115 pp 403-411.
• id: f00bbb6c-91f7-4c7e-a775-6a00b06f846a (old id 544884)
• date added to LUP: 2016-04-01 16:12:54
• date last changed: 2018-11-21 20:39:39