Towards Generation of Human Hematopoietic Stem Cells from Pluripotent Stem Cells.

Abstract

There is a pressing need for compatible Hematopoietic Stem Cells (HSCs), in high quantities and of good clinical quality, to ensure optimal treatment for patients with various blood malignancies. Pluripotent Stem Cells (PSCs) have the potential to be a source for generating HSCs. The indefinite expansion capacity of PSCs, combined with the possibility of creating these cells from patient-specific material could, in principle, allow for the generation of patient-derived HSCs. Generation of HSCs from PSCs could dramatically improve the treatment of patients in the clinic, including the possible correction of genetically carried hematological diseases. Furthermore, successful generation of HSCs would provide a tool to better study the nature of hematological malignancies, and could be employed for the purpose of drug screening

With the ultimate goal of facilitating in vitro generation of functional HSCs from human PSCs, the studies included in this thesis explore potential key factors and mechanisms involved in the process of hematopoietic development.

In paper I we describe that control over the amount of retinoic acid during in vitro differentiation of human PSCs increase blood generation, allowing for more defined and efficient production of relevant cells.

In paper II we provide a molecular identification of Endothelial to Hematopoietic Transition (EHT), the conversion through which HSCs emerge from endothelial cells. This provides a foundation for further characterization of the cells undergoing this transition, and could potentially enable control over this process for the purpose of more efficient generation of hematopoietic cells from hemogenic endothelium.

In paper III we explore how cAMP intrinsically regulates the generation of HSC-like cells, and we demonstrate the importance of cAMP signaling in the emergence of HSCs. Modulating cAMP provides an additional approach to increase the generation, and potentially the function, of HSC-like cells from human PSCs.

In paper IV, we demonstrate that reactive oxygen species is increased due to in vitro culture, causing functional impairment of hematopoietic progenitors and HSC-like cells generated from human PSCs. This argues that we must revise our standardized culture methods, and that a more physiological oxygen concentration is likely to be a critical component for handling and generating HSCs outside of the body.

In summary, the papers included in this thesis focuses on understanding the development of human HSCs, with the ultimate goal of developing methods that would enable the generation of functional HSCs in the laboratory, potentially translating into improved treatments against a multitude of hematological malignancies.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Idag har patienter med blodcancer (leukemi) eller genetiskt betingade blodsjukdomar (sickelcellanemi etc.) begränsad tillgång till behandlingar som effektivt och riskfritt botar sjukdomstillståndet. Detta arbete inkluderar forskningsresultat ämnade att bidra till utveckling av konceptuellt nya behandlingsmetoder för olika typer av blodsjukdomar.

Ett fungerande blodsystem är nödvändigt för varje individs överlevnad. De röda blodkropparna (erytrocyterna) förser kroppen med syre från lungorna, och de vita blodkropparna (leukocyterna) utgör vårt immunförsvar mot infektionssjukdomar. Blodceller slits snabbt ut och för att ersätta dessa behöver kroppen varje dag tillverka cirka 1 biljon nya blodceller. Ansvarig för denna kontinuerliga nyproduktion av blodceller är en sällsynt typ av blodceller som kallas för Hematopoetiska stamceller (HSCs), även kallade blodstamceller. Blodstamceller återfinns i benmärgen där de stundtals genomgår celldelning. Vid celldelning kan en dottercell påbörja en mognadsprocess där, efter många nya celldelningar, ett stort antal av färdiga blodceller resulterar. Blodstamceller är därför centrala för att våra kroppar ska kunna förses med nya blodceller genom livet. Blodstamceller är dock väldigt känsliga och kan fallera om de utsätts för skadliga faktorer som olika kemiska substanser, eller radioaktiv strålning. Vid behandling av blodcancer används idag ofta sådana faktorer för att ta död på cancercellerna. Dessa behandlingar medför ofta att även kroppens friska blodstamceller förstörs, vilket kan resultera i blodsystemets kollaps och patientens avlidande om detta inte åtgärdas. Därför genomgår patienter som genomgått cancerdödande behandling ofta en transplantation där blodstamceller från en donator införs i patientens kropp. Om transplantationen lyckats återetablerar donatorns blodstamceller en kontinuerlig nyproduktion av blodceller vilket resulterar i patientens överlevnad. Men donatorbaserad transplantation av blodstamceller kan medföra komplikationer. Mängden blodstamceller som kan inhämtas från en villig donator kan vara begränsad vilket resulterar i en oönskat lång återhämtning för patienten. En donator måste även vara immunkompatibel med patienten (att deras immunförsvar har liknande karaktär) för att minimera risken att det nya immunförsvaret reagerar mot patientens egna vävnader. Ett sådant tillstånd där transplantatet angriper värden, på engelska Graft Versus Host Diesease (GVHD), är livsfarligt för patienten. Därför krävs en hög kompatibilitet mellan patient och donator vilket ytterligare begränsar antalet möjliga donatorer. Det finns därför ett stort behov av patientkompatibla blodstamceller för att kunna möjliggöra optimal och effektiv behandling mot olika blodsjukdomar. En möjlighet att förse detta behov är odling och produktion av blodstamceller i laboratoriet.

I början av den embryonala utvecklingen (strax efter äggets befruktning) finns en typ av stamceller som kan ge upphov till alla olika typer av celler och vävnader i den vuxna kroppen. Dessa stamceller kallas därför pluripotenta och kan, om de stimuleras på rätt sätt, odlas i laboratorium för att utvecklas till olika vuxna celltyper inklusive blod. Pluripotenta stamceller behöver inte nödvändigtvis erhållas från embryon. År 2007 lyckades ett japanskt laboratorium, lett av professor Shinya Yamanaka, med att framställa mänskliga pluripotenta stamceller från vuxna hudceller. Denna bedrift belönades med Nobelpriset i medicin år 2012, och innebar nya möjligheter att framställa pluripotenta stamceller från enskilda individer som till exempel patienter. Om det vore möjligt att framställa funktionsdugliga blodstamceller från pluripotenta stamceller skulle behandlingen av blodsjukdomar kunna förbättras avsevärt eftersom det teoretiskt sett vore möjligt att framställa obegränsade mängder av nya patientkompatibla blodstamceller.

Denna avhandling innehåller 4 olika forskningsstudier där det gemensamma målet är att utveckla en metod för att lyckas med att framställa mänskliga blodstamceller från pluripotenta stamceller.

I den första studien demonstrerar vi att Retinoinsyra, en metabolit av Vitamin A, har en negativ påverkan under utvecklandet av pluripotenta stamceller till blod. Genom att använda en kemisk substans vid namn (DEAB) för att blockera cellernas egen produktion av Retinoinsyra kan vi flerfaldigt förbättra framställningen av celler vilka liknar blodstamceller. Ökad förståelse hur regleringen av utvecklingsprocessen går till är viktigt för att specifikt och effektivt kunna framställa de celler som är av intresse.

I den andra studien undersöker vi i detalj hur de första blodstamcell-lika cellerna formas. Under utvecklingen uppstår de första blodstamcellerna från endotelceller som täcker blodkärlens insida. Denna process, där en icke-blodcell genomgår ett identitetsbyte till blod, kallas för Endotelisk till Hematopoetisk Övergång, på engelska Endothelial to Hematopoietic Transition (EHT), och detaljerad vetskap om hur denna process fungerar saknas. Genom att studera övergången från endotel till blodcell beskriver vi ett specifikt övergångstillstånd som sker centralt i denna process. Våra resultat låter oss för första gången identifiera och särskilja de celler som deltar i denna övergång, vilket kan komma väl tillhanda om vi bättre vill efterlikna den embryonala blodutvecklingen för att kunna framställa blodstamceller i laboratoriet.

I den tredje studien visar vi att utvecklingen av blodstamcell-lika celler är i kritiskt behov av Cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) vilket fungerar som en sekundär budbärare åt flera olika signalsubstanser. Genom att manipulera cellernas mängd av cAMP demonstrerar vi flerfaldigt ökad framställning av blodstamcell-lika celler. Våra resultat påvisar även att cAMP förmedlar sina positiva effekter genom ej hittills uppskattade signaleringsleder inom cellen. Dessa resultat ökar vår förståelse över vilka faktorer som krävs för effektiv framställning av blod.

I den fjärde studien demonstrerar vi att majoriteten av alla blodstamcell-lika celler har förhöjda nivåer av reaktiva syregrupper, på engelska Reactive Oxygen Species (ROS), vilket orsakar funktionsoduglighet. Vi påvisar att denna förhöjning av reaktiva syregrupper orsakas av flera olika processer vilka grundar sig i de metoder för cellodling som idag är generell praxis. Genom att använda samt kombinera fyra olika metoder för att minska mängden av reaktiva syregrupper kan vi för första gången effektivt framställa blodstamcell-lika celler med reducerade mängder av ROS. Dessa celler uppvisar kraftigt förbättrad kapacitet för tillväxt. Våra resultat argumenterar för att reaktiva syregrupper vilka resulterar från våra cellodlingsmetoder utgör ett allvarligt hinder, samt att en reducering sannolikt är en nödvändighet, för lyckad framställning av funktionsdugliga blodstamceller i laboratoriet.

Sammantaget presenteras i denna avhandling forskning inriktad på att förstå utvecklingsprocessen av blod, med syfte att möjliggöra framställning av blodstamceller från pluripotenta stamceller. Våra resultat ger ökad insikt i hur denna komplicerade process fungerar och det är vår förhoppning att dessa framsteg kan bidra till en framtida metod vilken möjliggör effektiv framställning av funktionella blodstamceller. Detta eftersom en sådan metod drastiskt skulle kunna förbättra behandlingen av patienter som lider av diverse blodsjukdomar.

• author: Rönn, Roger
• supervisor: Niels-Bjarne Woods; Stefan Karlsson
• opponent: M.D., Ph.D. Daley, George, Children’s Hospital, Boston, U.S.A.
• organization: StemTherapy: National Initiative on Stem Cells for Regenerative Therapy; Division of Molecular Medicine and Gene Therapy
• publishing date: 2015
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cell Biology
• keywords: Hematopoietic stem cells, pluripotent stem cells, embryonic development., in vitro differentiation
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2015:142
• pages: 62 pages
• defense location: Belfrage lecture hall, BMC D15, Klinikgatan 32, Lund
• defense date: 2015-12-17 14:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-7619-222-1
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 257b7d4c-3e70-47d0-8564-a7c3f50252ac (old id 8230932)
• date added to LUP: 2016-04-01 12:58:00
• date last changed: 2020-09-28 14:47:44