A Molecular Dissection of Mantle Cell Lymphoma - From gene expression analysis to functional evaluation of selected targets

Abstract

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive form of B-cell lymphoma (BCL) with poor clinical outcome. In this thesis, which is based upon five original papers, different approaches have been used to pinpoint and investigate molecular events that promote MCL tumor growth, progression or resistance to treatment. The aim has been to identify novel targets with the potential to eradicate malignant cells, including more resistant cell clones.



In Paper I-III, a previously defined MCL specific disease marker, SOX11, was functionally studied. Our results demonstrate that SOX11 is a tumor suppressor-like gene, exhibiting a central role in MCL tumor growth control. Using gene expression studies, we identified HIG-2 and CD24 as important downstream targets of SOX11, and due to their cell surface localization on MCL cells they are considered of potential therapeutic interest. Moreover, using functional screening with substances targeting components of the WNT pathway, WNT-related targets with SOX11-dependent growth regulation were identified. One of the targets, V-ATPase, a pH regulator, was shown to be sensitive to SOX11 levels. Validation studies confirmed that V-ATPase is localized on the plasma membrane of MCL cells, and is thus an interesting candidate for antibody-based treatment.



Despite the high response rate of MCL patients to initial treatment, a large number of patients relapse with a more treatment resistant disease. In Paper IV, the molecular mechanism behind developed resistance to cytarabine, a commonly used chemotherapeutic in treatment of MCL was investigated. Our results show that resistance to cytarabine in MCL is mediated by down-regulation of dCK at protein level. Importantly, cytarabine resistant cells were also shown to exhibit cross-resistance to other chemotherapeutic drugs (nucleoside analogues) acting similarly to cytarabine. Considering these findings, patients demonstrating cytarabine resistance in clinic should be offered non-nucleoside analogue based treatment.



Finally, in Paper V, we investigated the presence of a rare population of more treatment resistant cells, identified as side population (SP), in MCL. SP cells isolated from MCL patient material exhibited up-regulated expression levels of the early cell activation markers CD69 and CD44, in agreement with a stem-cell like origin. Of major importance, an enrichment of SP cells was observed in chemotherapy exposed cells, indicating that SP cells have functionally important features, and need to be further investigated in MCL.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Årligen diagnostiseras cirka 60 000 nya fall av cancer i Sverige (Socialstyrelsen, 2015), och var tredje person beräknas få en cancerdiagnos under sin livstid. Trots stora framsteg inom forskning och utveckling är cancer, näst efter hjärt- och kärlsjukdomar, den vanligaste dödsorsaken i vårt samhälle.



Bland de tio vanligaste formerna av cancer hör lymfom, vilket är ett samlingsnamn för cancer som utvecklas från vita blodkroppar. Vita blodkroppar utgör människans immunförsvar och är celler som försvarar kroppen mot angrepp från virus, bakterier och andra sjukdomsalstrande organismer, så kallade patogener. En viktig typ av vita blodkroppar kallas för B lymfocyter eller B-celler. Dessa har i uppgift att producera och utsöndra en typ av protein, antikropp, vars funktion är att bekämpa patogener. En B-cell bildas och mognar i benmärgen innan den transporteras till det cirkulerade blodet och lymfatiska systemet. I det lymfatiska systemet, genomgår B-celler en utvecklingsprocess för att kunna producera antikroppar med god urskiljningsförmåga. För det mesta fungerar denna utvecklingsprocess alldeles utmärkt, men i sällsynta fall är det något som går fel och detta kan ge upphov till uppkomst av så kallat B-cellslymfom.



Beroende på var i utvecklingsprocessen felet uppstår, bildas olika typer av B-cellslymfom. Såväl prognosen som behandlingen ser olika ut för dessa lymfom. En av de mest aggressiva B-cellslymfomen är mantelcellslymfom (MCL). Patienter med MCL har en medelöverlevnad på bara 3-7 år. Dessa patienter har oftast en utbredd sjukdom som kräver intensiv kombinationsbehandling med antikroppar, cytostatika, benmärgstransplantation och eventuell strålning. Trots detta är frekvensen av återfall stor.



I denna avhandling har jag använt mig av olika metoder för att identifiera och undersöka molekylära förändringar, och cellpopulationer, som stimulerar MCL tumörtillväxt, återfall och/eller resistens, med syftet att definiera nya målproteiner för effektivare behandling av MCL.



Alla celler i kroppen, både friska och sjuka, kan identifieras på grundval av unika proteiner (genprodukter) som dessa uttrycker på cellytan eller inuti cellen. Dessa proteiner fungerar som en sorts fingeravtryck för cellen, och regleras redan på gennivå. Genom att studera det mänskliga genomet (bestående av cirka 25000 gener) med hjälp av så kallade transkriptionsanalyser, kan man identifiera vilka specifika gener som är mest aktiva och unikt uttryckta i ett visst studerat material under ett visst förhållande.



SOX11 är ett exempel på ett protein som med hjälp av transkriptionsanalyser identifierats av vår forskargrupp som specifikt uttryckt i MCL, och som senare visat sig ha en diagnostisk roll i denna sjukdom. Trots dess användbarhet i diagnostik, har funktionen och regleringen av SOX11 i MCL längre varit okänd. I Paper I kunde vi för första gången visa att nedreglering av SOX11 i MCL celler medför ökad tumörpotential och ger upphov till aggressivare tumörer i möss. Vidare kunde vi med hjälp av transkriptionsanalyser identifiera SOX11 co-reglerade gener (Paper II), och visa att motsvarande genprodukter (proteiner) finns uttryckta på ytan av MCL celler och skulle kunna användas som möjliga terapeutiska angreppspunkter. Genom att screena bibliotek med små molekyler har vi dessutom kunnat identifiera inhibitorer med anti-proliferativ effekt relaterat till SOX11 uttryck i cellerna (Paper III). Sammantaget har resultaten i Paper I-III bidragit till en ökad förståelse för funktionen och regleringen av SOX11 i MCL, samt identifierat möjliga målproteiner på ytan av dessa celler som skulle kunna användas för terapeutiskt syfte i MCL.



Trots förbättringar i behandlingsprotokoll och oftast god initial respons på behandling, får majoriteten av MCL patienter återfall och blir svårbehandlade. Återfall i MCL är den främsta orsaken till patientdöd (Desai et al., 2014), och har påvisats vara relaterad till närvaro av sällsynta stamcellsliknande kloner eller subpopulationer av celler som är i) motståndskraftiga mot viss cytotoxisk substans, ii) har ökad förmåga att aktivt pumpa ut cytotoxiska substanser, iii) får skydd av mikromiljön, eller iv) genomgår epigenetiska förändringar. I denna avhandling har jag på molekylär nivå studerat den bakomliggande orsaken till utvecklad resistens mot cytarabin (ara-C) (Paper IV), ett vanligt förekommande cytostatika som används för behandling av yngre (<65 år) MCL patienter. Cytarabin administreras i en inaktiv form och måste först transporteras in till cellen och därefter genomgå flertal aktiveringsprocesser för att bli en aktiv metabolit som kan inkorporeras i den växande DNA-strängen och avstanna celldelningen. Genom att etablera en cytarabin-resistent modell har vi kunnat påvisa i Paper IV att resistensen mot cytarabin är kopplad till nedregleringen av deoxycytidinkinas (dCK), ett enzym som är ansvarig för den allra första cytarabin associerade aktiveringsprocessen inne i cellen. Vidare har vi i Paper IV kunnat visa att cytarabin-resistenta celler är även korsresistenta mot andra cytostatika som är snarlika med cytarabin, så kallade nukleosidanaloger. Denna information har klinisk nytta eftersom patienter som är resistenta mot cytarabin bör undvika att bli behandlade med nukleosidanaloger. För att identifiera cytarabinresistenta återfallspatienter, bör dCK proteinuttryck utvärderas inför val av behandling med nukleosidanaloger.



Avslutningsvis, har vi i Paper V undersökt närvaron av celler med ökad förmåga att aktivt pumpa ut cytotoxiska substanser, definierad som side population (SP). Vi har kunnat identifiera SP celler i både MCL primärt material och cell linjer, och har med hjälp av avancerad teknik (fluorescens-aktiverad cellsortering) kunnat isolera dessa lågfrekventa celler, som representerat <0.5% av totala cellantalet. Isolerade SP celler har kunnat visa förmågan att reproducera sig själva både in vitro (i cellkultur) och in vivo (i möss). Dessutom har vi för första gången visat att SP celler anrikas i kemoterapi-resistenta MCL cell linjer, och har med hjälp av transkriptionsanalyser kunnat identifiera ett ökat uttryck av CD69 (involverad i lymfocytproliferering) och CD44 (cancerstamcellsmarkör). Sammanfattningsvis verkar SP celler representera en biologisk intressant cellpopulation, men ytterligare studier är nödvändiga för att klargöra dess betydelse i MCL.

• author: Kuci, Venera
• supervisor: Sara Ek; Carl Borrebaeck
• opponent: Professor Stamatopoulos, Kostas, Institute of Applied Biosciences, Center for Research and Technology Hellas, Thessaloniki, Greece
• organization: Department of Immunotechnology; BioCARE: Biomarkers in Cancer Medicine improving Health Care, Education and Innovation
• publishing date: 2016
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Immunology in the medical area
• keywords: side population, deoxycytidine kinase, resistance, SOX11, mantle cell lymphoma
• defense location: Lecture hall Hörsalen, Medicon Village, Scheelevägen 2, Lund University, Faculty of Engineering
• defense date: 2016-04-08 09:15:00
• ISBN: 978-91-7623-712-0
• ISBN: 978-91-7623-711-3
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 520821a1-e417-427b-9835-3cc7953c50b0 (old id 8841379)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:28:11
• date last changed: 2019-11-04 10:54:57