The role of PKC in neuronal differentiation and in regulation of the actin cytoskeleton during neurite outgrowth

Abstract

Protein kinase C (PKC) is a family of serine/threonine kinases subgrouped into classical (α, βI, βII, γ), novel (δ, ε, η, θ) and atypical (ζ, ι/λ) isoforms. PKC can be activated by phorbol esters, and prolonged treatment of neuroblastoma cells has been shown to induce neuronal differentiation with neurite outgrowth and increased expression of neuronal genes. Here we show that a classical PKCβ isoform is important for the phorbol ester-induced gene expression via the MAP kinases Erk 1/2.



A previous study has shown that novel PKCε, via its regulatory domain, induces neurites in neuroblastoma cells. In this thesis we show that membrane localization and an actin-binding site in the regulatory domain is important for this effect. Besides neuroblastoma cells, the regulatory domain of PKCε is sufficient to induce cellular processes in both immortalized neural cells and fibroblasts, indicating that it targets commonly used cytoskeletal proteins. Furthermore, the catalytic activity of PKC is not only dispensable, it counteracts the neurite-inducing capacity of the regulatory domain.



Overexpression of PKCδ does not induce the formation of long cellular extensions by itself. However, treatment with phorbol ester triggers the formation of processes in PKCδ-overexpressing cells. This provides a model system to study initial cytoskeletal changes, which revealed that stress fiber loss accompanies outgrowth of processes. This indicates that the small GTPase RhoA, which is the main regulator of stress fiber formation, is suppressed. Furthermore, overexpression of a constitutively active RhoA blocked both PKC-mediated stress fiber loss and neurite outgrowth. A possible mechanism for the RhoA suppression is via p190RhoGAP, with which PKCε forms a complex. Cdc42 was further shown to be crucial for the PKC-mediated stress fiber loss, and both Rac1 and Cdc42 are important for PKC-mediated outgrowth of cellular processes.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Proteinkinas C (PKC) är en familj enzymer (protein som påskyndar cellulära förlopp) bestående av åtminstone 10 medlemmar (isoformer) vilka är involverade i ett flertal cellulära processer. Varje isoform är namngiven med en grekisk bokstav och beroende på olika egenskaper hos enzymerna kan PKC familjen delas in i tre undergrupper, de klassiska (α, βΙ, βΙΙ och γ), de nya (δ, ε, η och θ) och de atypiska (ζ och ι/λ) isoformerna. Strukturen av PKC kan delas in i två delar, varav ena halvan utgör den katalytiska domänen, vilken innehar den enzymatiska aktiviteten hos proteinet. Den andra halvan utgör den regulatoriska domänen, vilken binder ämnen som reglerar aktiviteten hos enzymet. PKC regleras normalt av faktorer så som fettmolekylen diacylglycerol och kalcium joner. Dessa aktivatorer leder till att PKC förflyttas ut till cell membranet, vilket är det yttre höljet som omger cellen, där det aktiveras. De klassiska och nya isoformerna kan även förflyttas och aktiveras artificiellt genom tillsats av en grupp kemikalier, så kallade forbolestrar.



Neuroblastom är en barntumör i det sympatiska nervsystemet som uppstår när en omogen nervcell förlorar förmågan att utvecklas till en mogen nervcell och istället förökar sig ohämmat, vilket leder till att en tumör bildas. Celler från sådana tumörer kan isoleras och odlas i cellodlingsskålar, vilket ger en möjlighet att studera deras egenskaper. Tidigare studier har visat att genom att behandla cellerna med forbolestrar under en lång tid så slutar tumörceller växa och mognar (differentierar) istället. De behandlade cellerna har ökat produktionen av proteiner specifika för mogna nervceller samt förändrat sitt utseende genom utväxt av utskott (neuriter).



Olika PKC isoformer har visat sig vara inblandade i de olika processerna. Klassiska isoformer är inblandade i regleringen av proteinproduktionen, medans de nya isoformerna är viktiga för neuritutväxten. Genom att använda olika kemiska ämnen som specifikt hämmar den katalytiska aktiviteten har vi i ett delarbete visat att en PKCβ isoform är inblandad i regleringen av proteinproduktionen som sätts igång efter behandlingen med forbolestrar.



Eftersom forbolestrar aktiverar ett flertal PKC isoformer och de flesta kemikalier som hämmar deras aktivitet blockerar fler än en isoform så är det svårt att definiera vilken isoform som är ansvarig för en viss effekt. Genom att föra in flera kopior av genen för en specifik PKC isoform i cellerna så leder det senare till en ökad mängd av själva proteinet. Detta härmar en aktivering av proteinet och man får därmed en indikation på vilka cellulära processer just den isoformen är inblandad i. Tidigare resultat från vår grupp har visat att ökad mängd av PKCε i cellerna leder till neuritutväxt hos neuroblastomcellerna. Denna effekt var oberoende av den katalytiska aktiviteten och medierad via den regulatoriska domänen. I den här studien har vi fortsatt att undersöka mekanismen bakom den här effekten. Våra resultat visar att neuritutväxten inte bara är oberoende av den katalytiska aktiviteten, utan att den faktiskt motverkar den neurit-inducerande förmågan hos den regulatoriska domänen.



Vi fann även att ökad mängd av PKCε ger neuritutväxt i neuronala celler som inte härstammar från tumörer, vilket visar att effekten inte beror på någon abnormalitet som kan finnas i tumörceller. Även i icke-neuronala celler, så som fibroblaster (finns i bindväven), inducerar PKCε utväxt av långa utskott, vilket betyder att PKCε påverkar mekanismer som finns i flera olika celltyper.



I motsatts till PKCε så ger överuttryck av PKCδ inte någon utväxt. Vi upptäckte dock att genom att stimulera celler som har förhöjd mängd av PKCδ med forbolestrar så kan utväxten av utskott induceras. Detta gav oss ett modellsystem för att studera de initiala förändringarna som sker under utväxten av långa utskott, vilket är beroende av dynamiska förändringar av cellens skelett, kallat cytoskelett. Detta är uppbyggt av tre olika strukturer vilka alla ger upphov till långa ”trådar” (filament). En av dessa strukturer är aktin-cytoskelettet, vilket är reglerat av så kallade små G-bindande proteiner tillhörande Rho-familjen. De mest studerade medlemmarna av denna familj är RhoA, Rac1 and Cdc42, vilka ger upphov till tydliga strukturer av aktin-cytoskelettet. RhoA leder till ”stressfiber” vilka består av flera aktinfilament hopbuntade till kraftiga fibrer som sträcker sig över hela cellen från ena sidan till den andra. Rac1 och Cdc42 ger mer dynamiska strukturer på cellytan, vilka är viktiga för migrationen av hela celler eller av tillväxtkonen, vilket är en struktur längst ute på neuriten som känner av omgivningen och leder utväxten. Generellt så är deras effekt på neuritutväxt att RhoA hämmar, medans Rac1 och Cdc42 har en positiv inverkan på utväxten.



Vi fann att neuritutväxten är åtföljt av en förlust av stressfibrerna, vilket tyder på att aktiviteten hos RhoA är nedreglerad. En muterade variant av RhoA som är konstant aktiv blockerade både den PKC-medierade neuritutväxten och stressfiber förlusten. Dessa resultat tyder på att den neurit-inducerande effekten av PKC involverar en inaktivering av RhoA. Våra resultat antyder att en möjlig mekanism för hur detta sker är genom att PKCε interagerar med p190RhoGAP, vilket är ett protein som inaktiverar RhoA. Cdc42 kan även påverka aktiviteten hos RhoA, och vi fann att Cdc42 är inblandad i den mekanism varigenom PKC inducerar stressfiber förlust. Både Cdc42 och Rac1 var också viktiga för utväxten av PKC-inducerade neuriter.



Förutom effekten av PKC på aktin-cytoskelettet, så påverkar cytoskelettet funktionen av PKC. Den regulatoriska domänen i PKCε skiljer sig från de andra isoformerna i att den har en unik aktinbindande sekvens. Eftersom endast denna isoform ger neuritutväxt undersökte vi om denna aktinbindande region hade någon betydelse för den neurit-inducerande förmågan. Våra resultat visade att sekvensen var viktig för att proteinet ska kunna inducera neuritutväxt, troligtvist genom att reglera så att PKC har rätt form och lokalisering vid membranet.

• author: Trollér, Ulrika
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Fällman, Maria, Department of Molecular Biology, Umeå University, Sweden
• organization: Department of Translational Medicine
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cancer and Oncology
• keywords: cytogenetics, Genetik, cytogenetik, Rho-family, actin cytoskeleton, neurite, differentiation, PKC, regulatory domain, Genetics
• pages: 122 pages
• defense location: Main lecture hall, Pathology building, entr. 78, University Hospital MAS, Malmö
• defense date: 2003-12-12 10:15:00
• ISBN: 91-628-5896-3
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: A PKCβ isoform mediates phorbol ester-induced activation of Erk1/2 and expression of neuronal differentiation genes in neuroblastoma cells.Ulrika Trollér, Ruth Zeidman, Karin Svensson and Christer Larsson.(2001) FEBS Lett. 508, 126-130. Article: Protein Kinase Cε actin-binding site is important for neurite outgrowth during neuronal differentiation.Ruth Zeidman, Ulrika Trollér, Arathi Raghunath, Sven Påhlman and Christer Larsson.(2002) Mol Biol Cell. 13, 12-24. Article: Induction of neurites by the regulatory domains of PKCδ and ε is counteracted by PKC catalytic activity and by the RhoA pathway.Mia Ling, Ulrika Trollér, Ruth Zeidman, Cecilia Lundberg and Christer Larsson.Exp Cell Res. (In press) Article: A possible role for p190RhoGAP in PKCε-induced morphological effects.Ulrika Trollér, Arathi Raghunath and Christer Larsson.Cell Signal. (In Press) Article: Cdc42 is required for protein kinase C ε- and δ-induced outgrowth of cellular processes and stress fiber dismantling.Ulrika Trollér and Christer Larsson.(Manuscript) The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Molecular Medicine (013031200)
• id: 6cd9cc4f-6c9f-466b-b6ea-97dbea1f42c7 (old id 466370)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:03:59
• date last changed: 2018-11-21 20:56:31