Advanced

Ischemic Cell Death in the CNS - applications of a new in vitro model

Cronberg, Tobias LU (2004)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

När blodförsörjningen till hjärnan upphävs uppstår ett tillstånd av blodbrist, ischemi. När hela hjärnan drabbas, som vid ett hjärtstillestånd, kallas detta global ischemi medan fokal ischemi betecknar att blodflödet är upphävt i en del av hjärnan, som vid stroke. Hjärt- och kärlsjukdomar, till vilka stroke också räknas, utgör idag ett dominerande hälsovårdsproblem i västvärlden och kostnaderna kan förväntas öka i takt med att befolkningen blir äldre. Våra kunskaper om de mekanismer som leder fram till att nervceller skadas och dör till följd av ischemi har ökat avsevärt under de senaste årtiondena till följd av en omfattande grundforskning inom området. Kunskaper om de faktorer som påverkar... (More)
Popular Abstract in Swedish

När blodförsörjningen till hjärnan upphävs uppstår ett tillstånd av blodbrist, ischemi. När hela hjärnan drabbas, som vid ett hjärtstillestånd, kallas detta global ischemi medan fokal ischemi betecknar att blodflödet är upphävt i en del av hjärnan, som vid stroke. Hjärt- och kärlsjukdomar, till vilka stroke också räknas, utgör idag ett dominerande hälsovårdsproblem i västvärlden och kostnaderna kan förväntas öka i takt med att befolkningen blir äldre. Våra kunskaper om de mekanismer som leder fram till att nervceller skadas och dör till följd av ischemi har ökat avsevärt under de senaste årtiondena till följd av en omfattande grundforskning inom området. Kunskaper om de faktorer som påverkar skadeutvecklingen, som tex. kroppstemperaturen och blodsockernivån har bekräftats i kliniska studier och blivit en del av det rutinmässiga omhändertagandet vid stroke och hjärtstillestånd. Ett stort antal substanser har visat sig skydda mot ischemisk hjärnskada i djurmodeller men hittills har ingen av dessa, trots ett antal kliniska studier, visat sig minska hjärnskadan hos människor. Detta dystra faktum understryker behovet av en fortsatt kartläggning av de grundläggande mekanismerna vid ischemi i hjärnan och av att skapa försöks-modeller som mer efterliknar de kliniska tillstånden. Experimentella modeller av hjärnischemi kan grovt delas in i in vivo modeller där hela djur används och in vitro modeller där istället cellkulturer eller färsk vävnad används. Vi har etablerat en metod för att odla vävnadssnitt från mushippocampus i vårt laboratorium. I dessa snitt bibehålls kontakterna mellan nervceller och samspelet mellan nervceller och stödjeceller, astrocyter. Hippocampus är en hjärnregion där nervcellerna är särskilt känsliga för ischemi, ffa. i den sk. CA1-regionen . För att efterlikna ett tillstånd av ischemi utsatte vi kulturerna för syre- och glukos brist och studerade vilka effekter detta hade på cellöverlevnad. Vi fann att om vi samtidigt med syre-och glukosbrist ändrade halterna av viktiga salter i det medium som omger kulturerna till de nivåer man uppmätt i hjärnan vid ischemi (med högt kalium, lågt calcium och lågt pH-värde) så förändrades utvecklingen av skada. Skadan begränsades nu till CA1-regionen, den blev mildare och den utvecklades långsammare. Var för sig hade såväl en sänkning av calcium som ett sänkt pH-värde en skyddande effekt. Sammantaget fick vi en skadebild som mer liknar den man ser hos försöksdjur och människor efter en motsvarande lång global ischemi. Till skillnad från tidigare in vitro modeller fann vi också att glukostillförsel ökade skadan i vårt anpassade medium och gav en ytterligare fördröjd skadeutveckling. Höga glukoshalter i blodet (hyperglykemi) leder till en ökad produktion av mjölksyra, laktat, en ytterligare sänkning av pH-värdet och en svårare hjärnskada vid stroke. Eftersom glukos skyddar effektivt mot syrgasbrist i en balanserad saltlösning har detta fenomen inte tidigare kunnat studeras i in vitro sammanhang. I separata försök fann vi att laktat eller en förstärkt pH-sänkning (pH 6.3) var för sig inte kunde förklara den skadliga effekten av glukos i vårt system. En måttlig sänkning av pH var däremot nödvändig för att den skadliga effekten av glukos skulle uppstå. Vi hade nu tillgång till två nya modeller för in vitro ischemi (IVI) och hyperglykem IVI och vi jämförde dessa på en rad områden. Vid IVI kunde celldöden helt förhindras genom att blockera den calciumgenomsläppliga NMDA-receptorn eller genom att använda ett calciumfritt medium vid skadetillfället. Ingen av dessa åtgärder hade någon effekt vid hyperglykem IVI. Där hade istället BAPTA-AM, som binder calcium inne i celler, en skyddande effekt. Att reaktiva och potentiellt skadliga syreföreningar, sk. fria radikaler bildas efter ischemi i hjärnan har tidigare visats liksom en skyddande effekt av substanser som hämmar dessa. Vi fann emellertid inget skydd av sådana substanser i någon av de två modellerna. I en separat studie fann vi att den skyddande effekten av acidos vid IVI var betydligt mer uttalad i hippocampus CA3-region jämfört med den närliggande CA1-regionen. Eftersom NMDA-receptorn blockeras vid lågt pH misstänkte vi att skillnader i blockering tex. pga. olika regional sammansättning av receptorn, kunde förklara våra fynd. Vi studerade NMDA-förmedlade signaler i CA1 och CA3 vid olika pH och fann en likvärdig och kraftig signalblockering i de båda regionerna men en mera kvarstående effekt i CA3-regionen, vilket kan representera en ökad regional inhibition och därigenom ett ökat skydd. Fördelen med att använda musvävnad är den rika tillgången på sk. transgena djur i vilka man förändrat uttrycket av enskilda gener för att studera dessas betydelse i sjukdomsprocesser. Adenosin är ett ämne som ingår i ämnesomsättningen och som förekommer rikligt i kroppen. Adenosin frisätts vid ischemi och kan, genom att binda till den sk. A1 –receptorn, minska frisättningen av glutamat och därigenom skydda mot skada. Vi odlade kulturer från djur som saknar A1 –receptorer och utsatte dessa för IVI men fann inte att skadeutvecklingen skiljde sig jämfört med kontrollkulturerna. Inte heller påverkades skadeutvecklingen av 8-CPT, en substans som blockerar A1 –receptorer. Inte heller vid global ischemi i en in vivo modell fann vi någon ökad skada hos djuren som saknade A1 –receptorer. Däremot gav 8-CPT en ökad skada in vivo. Dessa resultat kan bero på en skadlig system-effekt av 8-CPT. En alternativ förklaring är att adenosinberoende glutamatfrisättning är av mindre betydelse i vår in vitro modell jämfört med in vivo och att effekterna av A1 –receptor-avsaknad kompenserats genom en uppreglering av andra mekanismer i de djur som använts i in vivo försöken. Våra modeller för IVI och hyperglykem IVI representerar två skilda celldödsprocesser. IVI-inducerad celldöd följer ett klassiskt, NMDA- och calcium beroende mönster medan hyperglykem IVI leder till en annorlunda och hittills okänd celldödsmekanism. Vårt system lämpar sig väl för studier av mekanismer vid ischemisk hjärnskada då farmakologiska, genetiska, elektrofysiologiska och flourescens-mikroskopiska tekniker är lätta att applicera. Ett noggrant kartläggande av mekanismerna bakom IVI- och ffa. hyperglykem IVI-inducerad celldöd kan leda fram till nya behandlingsstrategier vid ischemisk hjärnskada. (Less)
Abstract
Ischemic brain damage is a common cause of death and disability. A global ischemic insult is usually the result of a transient cardiac arrest while occlusion of cerebral blood vessels leads to focal ischemic lesions, commonly termed stroke. During the last decades our knowledge about the metabolic and cellular events leading to cell death following ischemia has expanded mainly due to experimental studies in vivo and in vitro. Important findings concerning the relevance of body temperature and blood glucose levels have been confirmed in humans. However, a vast number of pharmacological agents with protective effects in animal models of ischemia have failed in subsequent clinical trials. This illustrates that our knowledge of the mechanisms... (More)
Ischemic brain damage is a common cause of death and disability. A global ischemic insult is usually the result of a transient cardiac arrest while occlusion of cerebral blood vessels leads to focal ischemic lesions, commonly termed stroke. During the last decades our knowledge about the metabolic and cellular events leading to cell death following ischemia has expanded mainly due to experimental studies in vivo and in vitro. Important findings concerning the relevance of body temperature and blood glucose levels have been confirmed in humans. However, a vast number of pharmacological agents with protective effects in animal models of ischemia have failed in subsequent clinical trials. This illustrates that our knowledge of the mechanisms of ischemic cell death is still incomplete and that we need to question the models we use to mimic the human disorders. We have used the organotypic tissue culture from mouse hippocampus to establish a new model of in vitro ischemia (IVI). Similar to previous models we combine anoxia and aglycemia but in addition we apply a combination of ions similar to what is found in the brain extracellular fluid during ischemia. We found that the combination of a high potassium level (70mM), a low calcium level (0.3mM) and acidosis (pH 6.8) during IVI made the pattern of cell death more similar to what is found following global ischemia in vivo in that became more delayed and selective. A high level of glucose was found to increase cell death in contrast to what had previously been found in other cell culture models of ischemia but in similarity to what is found in vivo. While cell death following IVI could be completely prevented by the withdrawal of extracellular calcium during the insult or antagonists of glutamatergic NMDA-receptors, no effect of either was found in the hyperglycaemic IVI paradigm. On the other hand, intracellular calcium chelation prevented against cell death following hyperglycaemic IVI but not IVI. Inhibition of free radicals was ineffective in both paradigms. These findings illustrates that IVI and hyperglycaemic IVI induces two different patterns of cell death both of which may be important during ischemia in vivo. Intraischemic acidosis protected neurons in the CA3-subregion of hippocampus more than in CA1. NMDA-receptors in both regions were inhibited by acidosis but they recovered significantly slower in the CA3-region. This prolonged inhibition could explain the sparing of the CA3-neurons following IVI and global ischemia. The neuromodulator adenosine inhibits glutamate release through presynaptic A1-receptors. We used transgenic A1-receptor knock-out mice to study the importance of this receptor for the development of cell death following IVI and global ischemia in vivo. No effect of the knock-out was found in any of the two paradigms. The A1-receptor antagonist, 8-CPT increased damage in vivo but had no effect in vitro. This discrepancy between the models could be explained by a less importance of vesicular glutamate release in vitro or an undiscovered systemic side-effect of 8-CPT in vivo. The described models of IVI and hyperglycaemic IVI are well suited for further studies on the pathophysiology of cerebral ischemia using transgenic, pharmacological, electrophysiological and imaging techniques. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
opponent
  • Professor Ottersen, Ole-Petter, University of Oslo
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
neuropsykologi, Neurologi, Neurology, astrocyte, stroke, adenosine, hyperglycaemia, glucose, free radicals, calcium, in vitro, brain ischemia, slice, neuropsychology, neurofysiologi, neurophysiology
pages
132 pages
publisher
Tobias Cronberg, Lab for Experimental Brain Research, Wallenberg Neuroscience Center, BMC A13, 221 84 Lund,
defense location
Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center, Sölveg. 17, Lund
defense date
2004-05-22 09:00
ISBN
91-628-6097-6
language
English
LU publication?
yes
id
8cd12332-4a8c-4b31-9dc9-37de723ed4ea (old id 466908)
date added to LUP
2007-09-07 13:09:24
date last changed
2016-09-19 08:45:10
@misc{8cd12332-4a8c-4b31-9dc9-37de723ed4ea,
  abstract     = {Ischemic brain damage is a common cause of death and disability. A global ischemic insult is usually the result of a transient cardiac arrest while occlusion of cerebral blood vessels leads to focal ischemic lesions, commonly termed stroke. During the last decades our knowledge about the metabolic and cellular events leading to cell death following ischemia has expanded mainly due to experimental studies in vivo and in vitro. Important findings concerning the relevance of body temperature and blood glucose levels have been confirmed in humans. However, a vast number of pharmacological agents with protective effects in animal models of ischemia have failed in subsequent clinical trials. This illustrates that our knowledge of the mechanisms of ischemic cell death is still incomplete and that we need to question the models we use to mimic the human disorders. We have used the organotypic tissue culture from mouse hippocampus to establish a new model of in vitro ischemia (IVI). Similar to previous models we combine anoxia and aglycemia but in addition we apply a combination of ions similar to what is found in the brain extracellular fluid during ischemia. We found that the combination of a high potassium level (70mM), a low calcium level (0.3mM) and acidosis (pH 6.8) during IVI made the pattern of cell death more similar to what is found following global ischemia in vivo in that became more delayed and selective. A high level of glucose was found to increase cell death in contrast to what had previously been found in other cell culture models of ischemia but in similarity to what is found in vivo. While cell death following IVI could be completely prevented by the withdrawal of extracellular calcium during the insult or antagonists of glutamatergic NMDA-receptors, no effect of either was found in the hyperglycaemic IVI paradigm. On the other hand, intracellular calcium chelation prevented against cell death following hyperglycaemic IVI but not IVI. Inhibition of free radicals was ineffective in both paradigms. These findings illustrates that IVI and hyperglycaemic IVI induces two different patterns of cell death both of which may be important during ischemia in vivo. Intraischemic acidosis protected neurons in the CA3-subregion of hippocampus more than in CA1. NMDA-receptors in both regions were inhibited by acidosis but they recovered significantly slower in the CA3-region. This prolonged inhibition could explain the sparing of the CA3-neurons following IVI and global ischemia. The neuromodulator adenosine inhibits glutamate release through presynaptic A1-receptors. We used transgenic A1-receptor knock-out mice to study the importance of this receptor for the development of cell death following IVI and global ischemia in vivo. No effect of the knock-out was found in any of the two paradigms. The A1-receptor antagonist, 8-CPT increased damage in vivo but had no effect in vitro. This discrepancy between the models could be explained by a less importance of vesicular glutamate release in vitro or an undiscovered systemic side-effect of 8-CPT in vivo. The described models of IVI and hyperglycaemic IVI are well suited for further studies on the pathophysiology of cerebral ischemia using transgenic, pharmacological, electrophysiological and imaging techniques.},
  author       = {Cronberg, Tobias},
  isbn         = {91-628-6097-6},
  keyword      = {neuropsykologi,Neurologi,Neurology,astrocyte,stroke,adenosine,hyperglycaemia,glucose,free radicals,calcium,in vitro,brain ischemia,slice,neuropsychology,neurofysiologi,neurophysiology},
  language     = {eng},
  pages        = {132},
  publisher    = {ARRAY(0xb16d308)},
  title        = {Ischemic Cell Death in the CNS - applications of a new in vitro model},
  year         = {2004},
}