Cloning and Characterization of Plasminogen-Binding Proteins from Nontypeable Haemophilus influenzae

Abstract

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) is a human-specific pathogen frequently associated with respiratory tract infections. Recruitment of human plasminogen is one of the multifaceted colonization and invasion strategies employed by NTHi. Plasminogen is a proenzyme abundant in human plasma. Physiological activators convert plasminogen to the proteolytically active broad-spectrum protease plasmin that degrades fibrin, extracellular matrix components, and complement proteins. Surface bound plasmin(ogen) can thus contribute to immune evasion, and aid in pathogenesis. Here, we show that clinical isolates of nontypeable H. influenzae interact with plasminogen. Using a proteomic approach, multiple plasminogen-binding proteins of NTHi (denoted as NPs) were previously identified in our lab. In the present study, we cloned and expressed NPs using the heterologous system Escherichia coli. Characterisation of plasminogen binding to purified recombinant NPs (n = 10) was performed. Recombinant NP3, NP10 and NP15 bound to immobilized plasminogen at high affinity (KD of 2.3, 2.7 and 3.7 nM, respectively). The plasminogen binding was mediated through lysine binding residues and involved ionic interactions. Plasminogen when bound to either NP3, NP10 or NP15, respectively, was accessible for activation to plasmin by urokinase-type plasminogen activator (uPA), and further degraded the chromogenic substrate S-2251. Subsequent studies with NP3 showed that bound plasmin(ogen) cleaved the natural substrate fibrinogen but no degradation of the complement protein C3b was observed during 24 hours. In conclusion, our study provides new insight into the virulence of NTHi that is mediated by binding of plasminogen.

Popular Abstract (Swedish)

Bakterier kidnappar det mänskliga proteinet plasminogen för egen vinning

Kroppen har utvecklat ett komplext system som skyddar oss från invaderande mikroorganismer. Genom att binda kroppsegna proteiner kan bakterier kidnappa detta försvar och främja sin egen spridning. Haemophilus influenzae är en av dessa sjukdomsframkallande bakterier vars ökande framfart väckt oro och lett till behovet av ett nytt vaccin alternativt nya läkemedel.

H. influenzae är en bakterie som finns i våra övre luftvägar och kan orsaka ett flertal sjukdomar hos oss människor. De så kallade icke-typbara stammarna är en undergrupp av H. influenzae som ofta är förknippade med öroninflammation, bihåleinflammation och ögoninflammation hos barn samt försämring av patienter med kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). I sällsynta fall kan dessa bakterier orsaka mer allvarliga sjukdomar så som blodförgiftning och hjärnhinneinflammation. Antibiotika används som läkemedel vid H. influenzae infektioner men i och med ökningen av antibiotikaresistens bland bakterier krävs alternativa metoder för att motverka infektioner. På senare tid har rapporter visat en ökning av lindriga sjukdomsfall orsakade av de icke-typbara stammarna av H. influenzae. Ett nytt botemedel eller vaccin behövs därför mot dessa bakterier. För att kunna ta fram substanser med terapeutisk potential krävs det kunskap på molekylnivå om den bakomliggande mekanismen vid infektion. Att ta fram sådan kunskap är lättare sagt än gjort!

När en bakterie tar sig in i kroppen möts den av vårt immunförsvar, ett komplext system uppbyggt av en rad olika skyddsmekanismer och barriärer som har det gemensamma målet att bekämpa farliga inkräktare. Bakterier har utvecklat egna listiga mekanismer för att kunna lura och övervinna detta försvar. H. influenzae, likt andra mikroorganismer, har förmågan att binda kroppsegna proteiner och på så sätt överta kontrollen över kroppens system. Ett sådant kroppseget protein är plasminogen. Plasminogen cirkulerar i vårt blod och finns dessutom i vävnad. När plasminogen kommer i kontakt med speciella aktivatorer, exempelvis urokinas plasminogen-aktivator (uPA), omvandlas den till sin aktiva form som kallas plasmin. Plasmin har en viktig roll i fibrinolysen, en process där blodkoagel bryts ner. Blodkoagel förhindrar blodförlust vid skador och blockerar bakteriers inträde till blodomloppet genom den skadade vävnaden. När kroppens sårläkningsprocess startar behövs inte pluggen av blodkoagel längre och den löses då upp av plasmin. Plasmin aktiverar även andra system i kroppen som bryter ner gammal och skadad vävnad för att främja uppbyggnaden av ny. Utöver detta reglerar plasmin delar av kroppens immunförsvar. Studier har visat att sjukdomsframkallande bakterier kan binda plasminogen till sin yta som sedan kan aktiveras till plasmin och promota bakteriens framfart.

I denna studie har vi visat att icke-typbara stammar av H. influenzae kan binda till mänskligt plasminogen. Vi har identifierat flertalet strukturer på bakteriens yta som är involverade i denna binding. Plasminogen bundet till dessa ytstrukturer kunde med hjälp av aktivatorn uPA aktiveras till plasmin. Plasmin i sin tur hade förmågan att bryta ner det naturliga proteinet fibrinogen som bygger upp blodkoagel, vilket tyder på en biologisk relevans. Strategin att binda plasminogen som sedan aktiveras till plasmin går att likna vid ett svärd som H. influenzae kan använda för att bryta ner kroppens barriärer och ta sig in i blodomloppet. Med hjälp av svärdet, dvs. plasmin(ogen) kan bakterien också kapa kroppens immunförsvar för att främja sin egen spridning och orsaka mer skada. Vi har visat att inhibitorn ε-ACA kan förhindra bakteriens ytstrukturer från att binda plasminogen. Vi tror att substanser liknande ε- ACA har potential för framtida användning vid bakteriella infektioner orsakade av H. influenzae. Det behövs mer kunskap om den exakta interaktionen mellan plasminogen och ytstrukturerna hos de icke-typbara stammarna av H. influenzae för att kunna ta fram den optimala kombinationen av substanser till ett nytt läkemedel eller vaccin. Med forskningens hjälp hoppas vi kunna ta fram sådana preparat inom en snar framtid och visa H. infleunzae att oss människor lurar man inte så lätt!

• author: Rizvanovic, Alisa
• supervisor: Peter Rådström; Yu-Ching Shanice Su; Kristian Riesbeck
• organization: Biotechnology
• course: KMB820 20151
• year: 2015
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: plasminogen, plasminogen-binding proteins, immune evasion, complement evasion, complement system, ECM, extracellular matrix, human-specific, repiratory tract, invasion strategy, nontypeable, colonization strategy, Haemophilus influenzae, teknisk mikrobiologi, applied microbiology
• language: English
• id: 7853932
• date added to LUP: 2015-10-06 08:39:33
• date last changed: 2015-10-06 08:39:33