Cloning of an insulin-carrying nanocontainer in a Hepatitis B virus system

Abstract (Swedish)

Studies of virus capsids opens up new opportunities to develop different kind of cargo systems, but also the understanding of the transportation and the releasing of different kinds of cargo molecules. Virus capsids is a protein shell of a virus that encapsulates different types of infecting nucleic acid sequences in their native forms. One of these capsids is the Hepatitis B virus capsid that in nature carries the viral DNA for the hepatitis B disease. The core antigen in this capsid is build up by α-subunit dimer and in vitro these dimers can spontaneously self-assemble into a nanocapsid under right conditions. A previously invented system have shown the possibility to regulate the load and release of encapsulated cargo molecules instead of permanently fusing the protein to the α-subunit in the nanocontainer.[1] Successful modifications of this cargo system could in the future lead to better efficiency in drug transportation, gene therapy and other kind of treatments. In this work insulin is the target molecule that wants to be encapsulated because this could lead up to transportation of the insulin into cells and also to generate slow release of insulin out of the capsid.
The aim of this project was to exchange the protein sequence in the C-terminal of one of the α-subunits so that it in turn under right conditions could encapsulate insulin. This was made by designing a gene that contained single chain insulin on the C-terminal of one of the α-subunits. The theory is that this insulin togheter with five other insulin subunits forms a hexamer complex when Zn2+ ions are present, which upon self-assembly will make the hexamer complex on the inside of the capsid.
The aim was also to ease the purification of the protein capsids by introducing a polyhistidine-tag (his-tag) to the N-terminal of the subunits. This was made by designing a primer that contained the polyhistidine fragment, a small linker and then a primer which was able to stick to the designed insulin fragment to make it possible to amplify it by PCR. Since struggling with difficulties of low amplification results a touchdown PCR was investigated to increase the amplification yield.
This work has shown that touchdown PCR was a more efficient method than regular PCR for amplification of the designed primers in this work. Unfortunately, no conclusions of the theoretically constructed insulin system or the polyhistidine introduction can be drawn due to unsuccessful ligation and further studies needs to be carried out.

Popular Abstract (Swedish)

Insulin är ett litet blodsockerreglerande peptidhormon som bildas i bukspottskörteln och utsöndras i kroppen för att reglera glukosnivåerna, exempelvis efter förtäring. Detta synnerligen viktiga peptidhormon produceras inte i tillräcklig skala hos personer med sjukdomen diabetes. Tekniker för att ge personer har tidigare blivit upptäckt, men ytterliggare forskning kan bli implementerade för att öka effektiviteten ytterliggare. Därför är det intressant att studera och upptäcka nya sätt att optimera leveransen av proteinet till kroppen. Bland annat genom långsam utsöndring av insulinet och dessutom att leverera det över cellers dubbla lipidskikt, vilket inte är möjligt genom dagens standardbehandling.
Tidigare studier har visat att viruskapsider av diverse slag kan bli modifierade för att bära på olika typer av transportmolekyler. En av dessa är hepatit B viruskapsiden vars ena komponent, kallad HBcAg, ansvarar av själva enkapsuleringen av den skadliga DNA-sekvensen och återfinns innanför kapsidens lapidlager som återfinns ytterst på kapsiden och vars syfte är att tränga in genom cellers dubbla lipidlager så att det skadliga DNA som finns inuti kapsiden kan frisläppas inuti cellen. Proteinuttrycket av Hepatit B genen kan göras så att den endast kodar för HBcAg, vilket har öppnat upp för nya möjligheter att enkapsulera olika typer av transportmolekyler, och inte minst proteiner.
Studier har tidigare visat att dom 149 första aminosyrorna i HBcAg är kritiska för självsammansättningen vilket gör att dom resterande aminosyrorna kan bli modifierade till system som är av intresse. Denna studie bygger på ett tidigare upptäckt transporteringssystem där en extra peptidbit efter HBcAg var datormodulerad så att en α-helix uttrycktes efter dom 149 första aminosyrorna. Denna α-helix gjorde det möjligt för signalproteinet Calmodulin (CaM) i närvaro av Ca2+-joner blev inbundet runt om den modulerade helixen. När sedan kelatorn EDTA tillsates så bildades det ett kelatkomplex med Ca2+-jonerna vilket medförde att Calmodulinet släppte från helixen. Denna typ av reglerande frisättning bygger upp nya förutsättningar och tanken är att applicera detta system på andra typer av proteinsekvenser.
Syftet med denna studie är att utveckla det tidigare systemet så att kapsiden istället enkapsulerar insulin. Efter dom 149 första aminosyrorna är istället enkelkedjigt insulin infört som tillsammans med fem andra enkelkjedjor av insulin samt i närvaro av Zn2+-joner bildar en hexamer. Frisläppningen är precis som i den tidigare studien tänkt att vara reglerad med hjälp av en kelator. Syftet var även att införa en polyhistidin-tag i systemet för att enklare kunna rena fram kapsiderna med hjälp av affinitetskomatografi.
Trots upprepade försök lyckades inte insulingenen bli ligerad in i sin tänkta plasmid. Polyhistidin-taggen som användes för att amplifiera det tidigare systemet simultant med ligeringen gav inte heller något givande resultat. Ytterliggare studier behövs göras för att påvisa om det tänkta systemet fungerar i praktiken eller inte. Däremot lyckades arbetet påvisa att den nyligen utvecklade metoden touchdown-PCR gav ett bättre utbyte av polyhistidin-fragmentet jämfört med traditionell PCR.

• author: Hansson, Ragnar
• supervisor: Ingemar André
• organization: Department of Chemistry
• course: KEMK03 20161
• year: 2016
• type: M2 - Bachelor Degree
• subject: Chemistry
• keywords: Virus B Container, HBcAg, Insulin, Encapsulation
• language: English
• id: 8888277
• date added to LUP: 2017-07-04 07:26:42
• date last changed: 2017-07-04 07:26:42