Purification of Chlamydia trachomatis Ribonucleotide Reductase delta248
(2018) KEMK03 20181Department of Chemistry
- Abstract
- The enzyme Ribonucleotide Reductase (RNR) reduces ribonucleotides (NTPs) to deoxyribonucleotides (dNTPs), which are then used as building blocks in the synthesis of DNA. In this thesis are reported the expression and purification of a mutant version of Chlamydia trachomatis Ribonucleotide Reductase protein R1 , called Chlamydia trachomatis Ribonucleotide Reductase protein R1 Δ248. The R1 subunit of the “normal” version has an extended amino terminus in its primary sequence, and the R2 subunit has instead of a tyrosine, a phenylalanine. The mutant however, lacks the first 248 amino acids and therefore has a shorter amino terminus than the “normal” version. This causes it to only contain one ATP-cone instead of three, as in the normal... (More)
- The enzyme Ribonucleotide Reductase (RNR) reduces ribonucleotides (NTPs) to deoxyribonucleotides (dNTPs), which are then used as building blocks in the synthesis of DNA. In this thesis are reported the expression and purification of a mutant version of Chlamydia trachomatis Ribonucleotide Reductase protein R1 , called Chlamydia trachomatis Ribonucleotide Reductase protein R1 Δ248. The R1 subunit of the “normal” version has an extended amino terminus in its primary sequence, and the R2 subunit has instead of a tyrosine, a phenylalanine. The mutant however, lacks the first 248 amino acids and therefore has a shorter amino terminus than the “normal” version. This causes it to only contain one ATP-cone instead of three, as in the normal version.[1] Results from the purification and Dynamic Light Scattering analysis suggest that even though the extended amino terminus is not vital for enzyme activity, it’s necessary for the binding of dATP. dATP-Sepharose chromatography shows that the method is not efficient in purifying this protein. The lack of ATP-cones is discussed as the reason for this occurrence. Results from the Hydrophobic Interaction Chromatography shows the protein's characteristics of high hydrophobicity, and produces the protein in a satisfactory amount. (Less)
- Popular Abstract (Swedish)
- Målet med detta arbete var att rena fram proteinet Chlamydia trachomatis ribonucleotide reductase R1 Δ248. För att göra detta effektivt, med en så liten förlust av proteinet som möjligt under processen, så krävs kunskap om proteinets egenskaper. Med vetskapen att denna mutant, som saknar de första 248 aminosyrorna jämfört med den icke-muterade varianten, enbart har en ATP-kon medan den icke-muterande har tre stycken, så bör renings metoder baserade på ATP/dATP-inbindning vara undermåliga. I ATP-konerna sker själva aktiveringen samt inhiberingen av proteinets aktivitet genom att binda in antingen ATP, som ger ett aktivt enzym, eller dATP, som inaktiverar enzymet.
Metoder använda i detta projekt för att rena fram proteinet består av... (More) - Målet med detta arbete var att rena fram proteinet Chlamydia trachomatis ribonucleotide reductase R1 Δ248. För att göra detta effektivt, med en så liten förlust av proteinet som möjligt under processen, så krävs kunskap om proteinets egenskaper. Med vetskapen att denna mutant, som saknar de första 248 aminosyrorna jämfört med den icke-muterade varianten, enbart har en ATP-kon medan den icke-muterande har tre stycken, så bör renings metoder baserade på ATP/dATP-inbindning vara undermåliga. I ATP-konerna sker själva aktiveringen samt inhiberingen av proteinets aktivitet genom att binda in antingen ATP, som ger ett aktivt enzym, eller dATP, som inaktiverar enzymet.
Metoder använda i detta projekt för att rena fram proteinet består av dATP-Sepharose Chromatography och Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC). dATP-Sepharose metoden baseras på proteinernas förmåga att binda in dATP, d.v.s. ju bättre inbindningen av ATP till proteinet är, desto bättre är reningsresultatet, då större mängd av vårt protein binder till kolonn-mediet och kan elueras. HIC baseras istället på proteinernas hydrofobicitet, d.v.s ju högre salt koncentrationen på lösningen innehållande proteinet har, desto starkare interaktion mellan proteiner och kolonnens medium. Dessa elueras sedan med en linjär gradient m.h.a. en buffert innehållande samma typ av salt, där de proteinerna med lägst hydrofobicitet elueras först.
Resultatet av dATP-Sepharose kromatografin gav en låg proteinmängd, p.g.a. att proteinet enbart har en ATP-kon, och därmed binder ATP ineffektivt. Detta innebär att majoriteten av proteinet vi är intresserade av i lösningen, rinner igenom kolonnen istället för att binda in.
Resultatet för HIC metoden gav en betydligt större mängd protein, vilket påvisar proteinets höga hydrofobicitet egenskap, och var i slutändan en effektiv reningsmetod. Om mer tid hade funnits hade möjligheten till en fördjupad studie av proteinets egenskaper kunnat genomföras. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
http://lup.lub.lu.se/student-papers/record/8954663
- author
- Önnemar, Sofie LU
- supervisor
-
- Rohit Kumar LU
- organization
- course
- KEMK03 20181
- year
- 2018
- type
- M2 - Bachelor Degree
- subject
- keywords
- biochemistry, biokemi
- language
- English
- id
- 8954663
- date added to LUP
- 2018-08-13 12:09:00
- date last changed
- 2018-08-13 12:09:00
@misc{8954663,
abstract = {{The enzyme Ribonucleotide Reductase (RNR) reduces ribonucleotides (NTPs) to deoxyribonucleotides (dNTPs), which are then used as building blocks in the synthesis of DNA. In this thesis are reported the expression and purification of a mutant version of Chlamydia trachomatis Ribonucleotide Reductase protein R1 , called Chlamydia trachomatis Ribonucleotide Reductase protein R1 Δ248. The R1 subunit of the “normal” version has an extended amino terminus in its primary sequence, and the R2 subunit has instead of a tyrosine, a phenylalanine. The mutant however, lacks the first 248 amino acids and therefore has a shorter amino terminus than the “normal” version. This causes it to only contain one ATP-cone instead of three, as in the normal version.[1] Results from the purification and Dynamic Light Scattering analysis suggest that even though the extended amino terminus is not vital for enzyme activity, it’s necessary for the binding of dATP. dATP-Sepharose chromatography shows that the method is not efficient in purifying this protein. The lack of ATP-cones is discussed as the reason for this occurrence. Results from the Hydrophobic Interaction Chromatography shows the protein's characteristics of high hydrophobicity, and produces the protein in a satisfactory amount.}},
author = {{Önnemar, Sofie}},
language = {{eng}},
note = {{Student Paper}},
title = {{Purification of Chlamydia trachomatis Ribonucleotide Reductase delta248}},
year = {{2018}},
}