Methodology development for analyzing probiotic influences on the gastrointestinal flora in children with elevated risk of celiac disease

Abstract

Celiac disease is a chronic autoimmune disease which affects about 3 % of children in Sweden where most of them have an asymptomatic form making it difficult to detect. The bacterial composition in the gastrointestinal microflora can affect the intestinal barrier properties and the immune systems response to various dietary components. An unfavourable composition of the microflora can activate part of the immune system involved in chronic inflammation of celiac disease. Therefore, the aim of this study was to perform a methodology development to see if different extraction methods could influence the sequencing results of the gastrointestinal microflora. The results from this will then be used for analysing if probiotics can influence the gastrointestinal flora in children with an elevated risk of developing celiac disease. This methodology development was done by testing three different extraction methods with the help of next generation sequencing, data analysis and various bioinformatic tools. From the results it was determined that the bacterial composition was dominated by two different bacterial phylotypes Firmicutes and the Bacteroidetes which was not very surprising as it has been shown in other studies that the microbiota consists mainly of these two. The kit extraction (QIAamp Power Fecal DNA Kit, Qiagen) was able to identify most of the bacteria which are most common in the human gastrointestinal system. From the principal coordinates analysis, it was determined that the kit extraction and the extraction robot (EZ1 Tissue Kit, Qiagen) gave the most similar results but that the result depend more on the individual from where the sample came from rather than the method itself. The Simpson index showed that the kit extraction had the overall most even distribution as well as the smallest standard deviation. The shake extraction (QIAamp96 Power-Fecal QIAcube HT Kit and TissueLyzer II, Qiagen) was the method with the poorest distribution and the largest standard deviation. From the light of all this it was concluded that the kit extraction was the method best suitable for these samples.

Popular Abstract (Swedish)

I denna studie utvärderades tre metoder för att utvinna DNA ur bakterier från sex personers tarmflora.
Slutsatsen blev att kit extraktionen var den bästa metoden, men att personen som provet kom ifrån
påverkar resultaten mer än själva metoden i sig.
Celiaki är en så kallad autoimmun kronisk sjukdom vilket innebär att immunförsvaret angriper tarmens
slemhinna som ett gensvar på absorberat gluten. Gluten är en samling proteiner från vete, råg och korn.
Det finns inget känt botemedel mot celiaki, utan den enda behandling är en livslång glutenfri kost. Om
och när en individ utvecklar sjukdomen bestäms av ett komplext samband mellan genetiska anlag och
miljöfaktorer så som kost och infektioner. Sjukdomen är starkt förknippad med antikroppar som finns i
mer än 90% av patienter med celiaki men som inte finns i friska individer. Barn med dessa antikroppar
riskerar att utveckla sjukdomen senare i livet men idag finns inget att ge för att förhindra sjukdomen från
att bryta ut. Den drabbar ca 3% av barnen i Sverige där de flesta har en symptomfattig form vilket också
gör den mycket svår att upptäcka.
Bakteriekompositionen av tarmfloran kan påverka både tarmens barriäregenskaper och immunförsvarets
respons för olika beståndsdelar i kosten. En ogynnsam komposition kan då aktivera delar av
immunförsvaret som är involverat i kronisk inflammation av celiaki. Därför har det gjorts en studie för att
se om tillsatsen av goda bakterier i kosten kan minska responsen från immunförsvaret i tarmen hos barn
med förhöjd risk att utveckla sjukdomen. Vissa av dessa goda bakterier har visat kunna utöva skyddande
egenskaper på tarmens slemhinna och även kunna lindra symptom som uppstår när individer med celiaki
får i sig gluten. De vanligaste av dessa bakterier är Lactobaciller och Bifidobakterier. Båda kan hittas i
tarmfloran hos alla friska individer som är ett komplext ekosystem med över 400 olika bakterier. De
flesta av dessa kan hittas i tjocktarmen där det finns 1011 bakterier per gram av avföring. Tarmfloran i sig
varierar med ålder, kost, genetik och ursprung där variationen är ännu större mellan barn under tre år.
För att bättre kunna se om tarmfloran förändras genom att tillsätta goda bakterier i koster behöver man
kunna ta reda på exakt vilka bakterier som finns i tarmfloran.
En metodutveckling gjordes för att se om det är någon skillnad mellan tre vanliga befintliga metoder för
att utvinna DNA ur bakterier. Det är viktigt att utvinna DNA eftersom man vill framställa mer av en
specifik gen som gör det lättare att bestämma exakt vilka bakterier som finns i provet. Syftet med denna
studie var att se om olika metoder påverkar bestämningen av vilka bakterier man hittar i tarmfloran.
Avföringsprover samlades in från sex vuxna människor mellan 18 och 35 år. Sedan utvanns DNA på tre
olika sätt, det första genom att använda en extraktionsrobot, det andra genom att använda en kit
extraktion och det tredje genom skakextraktion vilket innebar att skaka provet kraftigt tillsammans med
små glaskulor. De två vanligaste bakterierna som hittades var samma i nästan alla 18 prover (6 personer
och 3 olika metoder). Som andra vanligast i ett skakextraktionsprov hittades en spännande bakterie som
heter Saccharibacteria. Denna fick sitt namn 2013 efter ett forskarlag hittade den i ett vattenreningsverk.
Den har också hittats i saliv från människor, men även i samband med svampar, kackerlackor, guldgruvor
med mera. Detta gör det konstigt att ett prov innehöll 39,3% av denna bakterie.
Resultatet från själva metodutveckling blev att skakextraktionen verkade ge opålitliga resultat och kit
extraktionen identifierade många av de vanligaste bakterierna i tarmen från flest personer.
Extraktionsroboten fick högst diversitet men resultatet som helhet verkade påverkas mer av personen
som provet kom ifrån istället för själva metoden i sig. Detta beror troligtvis på de stora skillnader som
finns i tarmflora mellan olika personer.
34
För att testa metoderna användes Next Generation Sequencing (NGS) som innebär att I denna studie utvärderades tre metoder för att utvinna DNA ur bakterier från sex personers tarmflora. Slutsatsen blev att kit extraktionen var den bästa metoden, men att personen som provet kom ifrån påverkar resultaten mer än själva metoden i sig. Celiaki är en så kallad autoimmun kronisk sjukdom vilket innebär att immunförsvaret angriper tarmens slemhinna som ett gensvar på absorberat gluten. Gluten är en samling proteiner från vete, råg och korn. Det finns inget känt botemedel mot celiaki, utan den enda behandling är en livslång glutenfri kost. Om och när en individ utvecklar sjukdomen bestäms av ett komplext samband mellan genetiska anlag och miljöfaktorer så som kost och infektioner. Sjukdomen är starkt förknippad med antikroppar som finns i mer än 90% av patienter med celiaki men som inte finns i friska individer. Barn med dessa antikroppar riskerar att utveckla sjukdomen senare i livet men idag finns inget att ge för att förhindra sjukdomen från att bryta ut. Den drabbar ca 3% av barnen i Sverige där de flesta har en symptomfattig form vilket också gör den mycket svår att upptäcka. Bakteriekompositionen av tarmfloran kan påverka både tarmens barriäregenskaper och immunförsvarets respons för olika beståndsdelar i kosten. En ogynnsam komposition kan då aktivera delar av immunförsvaret som är involverat i kronisk inflammation av celiaki. Därför har det gjorts en studie för att se om tillsatsen av goda bakterier i kosten kan minska responsen från immunförsvaret i tarmen hos barn med förhöjd risk att utveckla sjukdomen. Vissa av dessa goda bakterier har visat kunna utöva skyddande egenskaper på tarmens slemhinna och även kunna lindra symptom som uppstår när individer med celiaki får i sig gluten. De vanligaste av dessa bakterier är Lactobaciller och Bifidobakterier. Båda kan hittas i tarmfloran hos alla friska individer som är ett komplext ekosystem med över 400 olika bakterier. De flesta av dessa kan hittas i tjocktarmen där det finns 1011 bakterier per gram av avföring. Tarmfloran i sig varierar med ålder, kost, genetik och ursprung där variationen är ännu större mellan barn under tre år. För att bättre kunna se om tarmfloran förändras genom att tillsätta goda bakterier i koster behöver man kunna ta reda på exakt vilka bakterier som finns i tarmfloran. En metodutveckling gjordes för att se om det är någon skillnad mellan tre vanliga befintliga metoder för att utvinna DNA ur bakterier. Det är viktigt att utvinna DNA eftersom man vill framställa mer av en specifik gen som gör det lättare att bestämma exakt vilka bakterier som finns i provet. Syftet med denna studie var att se om olika metoder påverkar bestämningen av vilka bakterier man hittar i tarmfloran. Avföringsprover samlades in från sex vuxna människor mellan 18 och 35 år. Sedan utvanns DNA på tre olika sätt, det första genom att använda en extraktionsrobot, det andra genom att använda en kit extraktion och det tredje genom skakextraktion vilket innebar att skaka provet kraftigt tillsammans med små glaskulor. De två vanligaste bakterierna som hittades var samma i nästan alla 18 prover (6 personer och 3 olika metoder). Som andra vanligast i ett skakextraktionsprov hittades en spännande bakterie som heter Saccharibacteria. Denna fick sitt namn 2013 efter ett forskarlag hittade den i ett vattenreningsverk. Den har också hittats i saliv från människor, men även i samband med svampar, kackerlackor, guldgruvor med mera. Detta gör det konstigt att ett prov innehöll 39,3% av denna bakterie. Resultatet från själva metodutveckling blev att skakextraktionen verkade ge opålitliga resultat och kit extraktionen identifierade många av de vanligaste bakterierna i tarmen från flest personer. Extraktionsroboten fick högst diversitet men resultatet som helhet verkade påverkas mer av personen som provet kom ifrån istället för själva metoden i sig. Detta beror troligtvis på de stora skillnader som finns i tarmflora mellan olika personer. 34 För att testa metoderna användes Next Generation Sequencing (NGS) som innebär att man bestämmer ordningen på nukleotiderna. Dessa är beståndsdelar i DNA-molekylen och ordningen är unik för varje levande ting. Genom att bestämma ordningen på nukleotiderna kan man identifiera bakterierna i alla prover.

• author: Larsson, Carin
• supervisor: Pamela Canaviri Paz
• organization: Food Technology and Nutrition (M.Sc.)
• course: KLGM10 20181
• year: 2018
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• keywords: food technology, livsmedelsteknologi
• language: English
• id: 8959567
• date added to LUP: 2019-04-10 16:40:21
• date last changed: 2019-04-10 16:40:21